基于光谱法的脾虚胀满合剂指纹图谱研究

张文文，伍文彬，杨　慧，曾琦璐，钟林江，张文静

(1.成都大学 四川抗菌素工业研究所，四川 成都　610052；2.成都中医药大学 附属医院，四川 成都　610075；3.成都大学 药学与生物工程学院，四川 成都　610106)

0　引　言

随着中药与中药制剂的广泛应用，其质量控制一直都是中药研究与生产中的难点与热点，也是实现中药现代化生产的关键[1].由于中药含有的化学种类成分较多且复杂，测定其中少数几种成分指标难以完全定性，所以中药的质量控制比合成的化学药品难度要大很多.同时，因中药中这些成分通常在治疗方面具有协同作用，故应从化学成分整体角度评价其质量[2-4].中药指纹图谱是基于对中药物质整体作用的认识，借助于波谱和色谱等技术手段获得中药化学成分的光谱或色谱图，可以较充分地反映出中药复杂混合体系中各种化学成分量分布的整体状况，并将一些未明确的有效成分表征在图谱中，这对药物质量的控制和评价具有重要意义[5-8].中药指纹图谱包括红外光谱法、紫外光谱法、核磁共振波谱法、电化学法、薄层色谱法、高效液相色谱法、气相色谱法、毛细管电泳法等[9].其中，紫外—可见指纹图谱法能反映样品在200～900 nm波长下的吸收情况，具有简便快速、综合信息量大的特点；红外指纹图谱是混合物中各组分红外光谱的叠加，对中药的定性鉴别有良好的专一性，并且具有快捷、简单以及测试成本低廉等优点[10-11].

脾虚胀满合剂是由枳壳、生白术、干姜、槟榔、紫苏叶与炙甘草等多味中药组成的临床经验方，具有健脾行气、消痞除满之功效，常用于脾虚气滞证见腹胀腹满、不欲饮食、大便不畅、苔白腻与脉沉细者[12].本课题在前期研究中，已建立了脾虚胀满合剂的初步质量标准，包括枳壳、干姜、炙甘草的薄层鉴别项，以及柚皮苷、新橙皮苷、甘草苷和甘草酸的含量测定项.因脾虚胀满合剂由6味中药组成，化学成分众多，故其指标性成分不能代表其真实的发挥药效的物质基础，测定少数指标成分不足以说明合剂的质量.对此，本研究采用紫外指纹图谱和红外指纹图谱这2种中药指纹图谱分析方法，并增加了对脾虚胀满合剂在可见波长下吸收情况的分析，建立脾虚胀满合剂的紫外—可见指纹图谱和红外指纹图谱2种评价方法，以从整体上控制和评价本品的质量.

1　材料与仪器

1.1　材　料

实验所用的材料包括：溴化钾(光谱纯，批号，2017042101)，由成都科隆化学品有限公司生产；水为纯净水；脾虚胀满合剂10批，自制.本研究前期对脾虚胀满合剂的柚皮苷、新橙皮苷、甘草苷及甘草酸含量进行了测定，并规定了限度.其中5批样品符合规定，5批样品不符合规定(见表1).

表1　10批脾虚胀满合剂样品含量测定结果

注：“√"符合规定的限度；“×"不符合规定的限度.

1.2　仪　器

实验所用仪器包括：Tu-1810型紫外—可见分光光度仪(北京普析通用仪器有限责任公司)；Spectrum Two型红外光谱仪(Pekin Elmer公司)；BS-6KH型电子天平(上海有声衡器有限公司)；FW-5型压片机(天津博天胜达科技发展有限公司)；LD510-2R型电子天平(沈阳龙腾电子有限公司).

2　方法与结果

2.1　紫外—可见指纹图谱

2.1.1测试条件.

实验中，以水调整基线并作为参比液进行紫外光谱测定，使用UVWin紫外软件V6.0.0采集光谱，设定扫描波长为200～900 nm，光谱带宽为2 nm，采样间隔为1 nm，快速扫描，自动切换波长为361 nm.

2.1.2供试品制备方法.

1)精密吸取脾虚胀满合剂(批号，20170215)1 mL于100 mL容量瓶中，加水定容至刻度，摇匀，制得供试品溶液a.

2)精密吸取脾虚胀满合剂(批号，20170215)0.5 mL于100 mL容量瓶中，加水定容至刻度，摇匀，制得供试品溶液b.

3)精密吸取脾虚胀满合剂(批号，20170215)2 mL于10 mL容量瓶中，加水定容至刻度，摇匀，吸取1 mL于100 ml容量瓶中，加水定容至刻度，摇匀，制得供试品溶液c.

4)精密吸取脾虚胀满合剂(批号，20170215)1 mL于10 mL容量瓶中，加水定容至刻度，摇匀，吸取0.4 mL于100 mL容量瓶中，加水定容至刻度，摇匀，制得供试品溶液d.

5)精密吸取脾虚胀满合剂(批号，20170215)0.1 mL于10 mL容量瓶中，加水定容至刻度，摇匀，吸取2 mL于100 mL容量瓶中，加水定容至刻度，摇匀，制得供试品溶液e.

按“2.1.1"项下的测试条件对供试品进行测定，结果见图1.其中，供试品溶液d的紫外—可见图谱的吸光度大小适宜，峰谷明显.故供试品的制备方法确定为：取脾虚胀满合剂1 mL于10 mL容量瓶中，加水定容至刻度，摇匀，吸取0.4 mL于100 mL容量瓶中，加水定容至刻度，摇匀(即将脾虚胀满合剂用水稀释2 500倍)，即得.

图1脾虚胀满合剂稀释2 500倍的紫外—可见图谱

2.1.3精密度实验.

取脾虚胀满合剂(批号，20170215)，按“2.1.2"项下的方法制备供试品溶液，按“2.1.1"项下的测试条件连续测定6次.计算所得紫外—可见图谱在波长200 nm、223 nm、252 nm、282 nm、308 nm处吸光度的RSD%分别为0.35%、0.07%、0.29%、0.14%、0.45%.结果表明，仪器精密度良好.

2.1.4稳定性实验.

取脾虚胀满合剂(批号，20170215)，按“2.1.2”项下的方法制备供试品溶液，按“2.1.1"项下的测试条件，每隔1h测定1次.5 h内计算所得紫外—可见图谱在波长200 nm、223 nm、252 nm、282 nm、308 nm处吸光度的RSD%分别为0.57%、0.16%、0.94%、0.48%、1.54%.结果表明，样品在5 h内稳定性良好.

2.1.5重复性实验.

取脾虚胀满合剂(批号，20170215)，按“2.1.2"项下的方法制备供试品溶液，平行6份，并按“2.1.1"项下的测试条件，分别测定.计算所得紫外—可见图谱在波长200 nm、223 nm、252 nm、282 nm、308 nm处吸光度的RSD%分别为1.62%、0.97%、1.42%、0.98%、1.51%.结果表明，本方法重复性良好.

2.1.6脾虚胀满合剂紫外—可见光谱采集.

取10批脾虚胀满合剂样品，按“2.1.2"项下的方法制备供试品溶液，按“2.1.1"项下的测试条件分别进行测定.10批脾虚胀满合剂样品的紫外—可见光谱叠加图如图2所示.

图210批脾虚胀满合剂样品的紫外光谱叠加图

2.1.7对照紫外—可见指纹图谱的建立.

选择在前期研究中含量测定符合规定的4批样品(批号，20170215、20170220、20170227、20170305)，以其吸收强度的平均值为对照指纹图谱的吸收强度，得到对照紫外—可见指纹图谱如图3所示.

图3脾虚胀满合剂的对照紫外—可见指纹图谱

2.2　红外指纹图谱

2.2.1样品制备.

用平头微量进样针取10 μL脾虚胀满合剂于玛瑙研钵中，挥干，加入100 mg溴化钾，沿同一方向研磨均匀，取适量研细后的粉末平铺于红外压片模具中，以15 MPa压力压制2 min，将制备好的样片置于红外光谱仪中测定红外光谱.

2.2.2精密度考察.

取脾虚胀满合剂(批号，20170220)，按照“2.2.1”项下的方法压片，并连续测定6次.计算所得红外图谱中各特征峰的波数的RSD%分别为，0.0042%、0.0057%、0.0003%、0.0037%、0.0061%、0.0026%、0.0039%、0.1304%.结果表明，仪器精密度良好.

2.2.3稳定性实验.

取脾虚胀满合剂(批号，20170220)，按照“2.2.1”项下的方法压片，置于干燥器中保存，分别在0 h、1 h、2 h、3 h、4 h、5 h时测定.计算所得红外图谱中各特征峰的波数的RSD%分别为，0.0036%、0.0780%、0.0016%、0.0126%、0.0077%、0.0034%、0.0067%、0.0817%.结果表明，样品在5 h内稳定性良好.

2.2.4重复性实验.

取脾虚胀满合剂(批号，20170220)，按照“2.2.1”项下的方法，平行压制6片，测定，计算所得红外图谱中各特征峰的波数的RSD%分别为，0.0272%、0.0725%、0.0040%、0.01767%、0.0135%、0.0651%、0.0367%、0.1815%.结果表明，本方法的重复性良好.

2.2.5脾虚胀满合剂红外光谱采集.

取10批脾虚胀满合剂样品，按“2.2.1"项下的方法压片并分别测定，10批脾虚胀满合剂样品的红外光谱叠加图见图4.

图410批脾虚胀满合剂样品的红外光谱叠加图

2.2.6对照红外指纹图谱的建立.

选择在前期研究中含量测定符合规定的4批样品(批号为，20170215、20170220、20170227、20170305)，以其透光率的平均值为对照指纹图谱的透光率，得到对照红外指纹图谱如图5所示.

图5脾虚胀满合剂对照红外指纹图谱

2.3　限度要求

10批脾虚胀满合剂的紫外—可见指纹图谱在波长200 nm、223 nm、252 nm、282 nm、308 nm处的吸光度值如表2所示.

将脾虚胀满合剂样品的紫外—可见指纹图谱、红外指纹图谱分别与得到的对照指纹图谱进行相似度分析[13-14]，经数据处理软件“IBM SPSS statistics"中双变量相关“Kendall的tau-b"分析计算相似度.综合用于建立对照紫外—可见指纹图谱的4批脾虚胀满合剂在特征波长下的吸光度值、脾虚胀满合剂样品的紫外—可见指纹图谱、红外指纹图谱与对照指纹图谱的相似度.脾虚胀满合剂紫外—可见指纹图谱的吸光度值应分别满足200 nm(0.954～1.371 Abs)、223 nm(0.477～0.687 Abs)、252 nm(0.122～0.174 Abs)、282 nm(0.248～0.361 Abs)、308 nm(0.104～0.149 Abs)，紫外—可见指纹图谱与对照指纹图谱的相似度应不小于0.925，红外指纹图谱与对照指纹图谱的相似度应不小于0.861，结果如表3所示.

表2　10批脾虚胀满合剂紫外—可见指纹图谱吸光度值

表3　脾虚胀满合剂指纹图谱相似度分析结果

前期研究中，含量符合规定的脾虚胀满合剂(批号：20170303)，其紫外—可见指纹图谱在200 nm，223 nm，252 nm，282 nm，308 nm处的吸光度值满足标准，紫外—可见指纹图谱与紫外—可见对照指纹图谱的相似度为0.930，高于限度0.925，红外指纹图谱与对照红外指纹图谱的相似度为0.942，高于限度0.861.而含量不合格的5批样品的吸光度或相似度均不满足限度要求.

3　结　论

由于脾虚胀满合剂中药材较多，干扰较大，课题组尚未建立其他4味药材定性定量控制方法，故采用紫外—可见图谱与红外图谱的分析方法，并增加了对样品在可见波长下吸收情况的分析，建立脾虚胀满合剂对照紫外—可见指纹图谱和对照红外指纹图谱，从吸光度、样品图谱与对照图谱相似度等方面对脾虚胀满合剂的质量进行综合分析.

本研究首次将紫外—可见指纹图谱、红外指纹图谱应用到脾虚胀满合剂的质量评价中，确定了测试条件和供试品制备方法，并建立了脾虚胀满合剂的对照紫外—可见指纹图谱与对照红外指纹图谱，对脾虚胀满合剂样品进行了吸光度与相似度的分析.结合脾虚胀满合剂含量测定方法[12]与紫外—可见指纹图谱与红外指纹图谱分析方法，在测定指标性成分的同时，可从整体上控制脾虚胀满合剂的质量，从而提升脾虚胀满合剂的质量标准.