天然植物提取物对鸡肉肠中单增李斯特菌及产品特性的影响

王　卫，熊　纬，孙然然，吉莉莉，张佳敏，白　婷

(1.成都大学 肉类加工四川省重点实验室，四川 成都　610106；2.闻达食品配料有限公司，山东 大连　116000)

0　引　言

硝酸盐在肉制品的生产过程中具有发色、防腐、抑菌等功效，其廉价、高效和安全性虽通过长期的研究与应用已得到行业的公认，但若不当使用或滥用则可能导致形成硝胺的潜在风险[1].为此，寻找更为安全可靠、经济适用，能替代硝盐在肉制品生产中的多种功能添加剂一直受到的科研人员关注.目前，使用比较多的是芹菜汁粉类产品、天然香辛料和水果提取物及其微生物发酵产物[2-3].研究发现，单增李斯特菌广泛存在于自然界中，是一种常见的食源性致病菌和人畜共患病病原菌，具有极强的生存能力，可在较低温(低至-0.4℃)、酸性、高盐的环境中生长，其对低温肉制品，尤其是不经二次杀菌而依赖冷链和严格卫生条件来延长货架期的即食熟肉制品，极易导致较大的安全性隐患[4-5].相关研究表明，硝盐(硝酸盐和亚硝酸盐)虽对单增李斯特菌具有较好的抑制作用，但仍不能完全抑制其生长和将其杀灭，因此，实际生产中通常将有机酸盐与硝酸盐结合来控制并抑制单增李斯特菌的生长繁殖[6-8].可以说，有关单增李斯特菌在肉制品中的特性及其有效控制长期以来一直是肉品安全研究的重点[9]，而挑战实验也成为验证各种方法对单增李斯特菌等有害微生物抑制作用的有效手段[10-11].对此，本研究选择商业化的T4NW S、DV和CS天然植物提取物来替代硝盐在肉制品中的抑菌作用，以低温鸡肉肠为对象，单增李斯特菌作为靶向抑制菌株，采用经典化学防腐剂组合(1.56 mg/kg亚硝酸钠+3.5% SD4+5.5 mg/kg异抗坏血酸钠)与乳酸链球菌素Nisin作为比较，通过微生物挑战实验(MCT)对其抑菌效能进行研究，并进一步分析了植物提取物对产品色泽、pH值、水分含量、aw、质构等特性的影响，以期为替代硝盐功效并更为安全的天然植物提取物的应用，以及无硝产品的开发提供依据.

1　材料与方法

1.1　材　料

1.1.1材料与试剂.

1)肉料及试剂.鸡肉，购自四川玉冠农业股份有限公司；TSB(胰酪胨大豆蛋白肉汤)、MOX(改良牛津琼脂)、BHI(脑心浸出液肉汤)，购自北京路桥技术有限责任公司；琼脂、亚硝酸钠，购自成都金山化工有限公司；乙酸钠—双乙酸钠(SD4)，购自武汉丰竹林化学科技有限公司.

2)天然抑菌剂.T4NW S、DV和CS，由苏州闻达食品有限公司提供，其主要成分为柠檬、甜橙、葡萄柚、石榴提取物，以及发酵糖粗提物等.

3)供试菌种.单增李斯特菌为4株菌(ATCC 19114、ATCC 19115、ATCC 19116、ATCC 19117)的混合物，由上海慧耘生物科技有限公司提供.

1.1.2仪器与设备.

实验所用的仪器与设备包括：TU-1800型紫外—可见分光光度计(北京普析仪器公司)；AL-104型精密电子天平(上海梅特勒—托利多仪器设备有限公司)；300ES-12型半自动切片机(顺菱切片机有限公司)；XW-80A型涡旋振荡器(海门其林贝尔仪器制造有限公司)；PHS-3C-01型pH计(上海三信仪表厂)；HC-2518型高速离心机(安徽中科中佳科学仪器有限公司).

1.2　方　法

1.2.1实验组设置.

根据预实验的筛选及各商业化天然植物提取物的推荐使用量，并与传统经典研制与配伍(NaNO2异VC-Na+SD4)、天然微生物发酵产物(Nisin)进行组合搭配设置的实验组如表1所示.

表1　实验组设置

1.2.2鸡肉肠制备.

本实验用鸡肉肠产品配方如表2所示.

表2　鸡肉肠产品配方

鸡肉肠产品制作工艺与常规工业化低温鸡肉肠产品相同，即：原料解冻后切块，入斩拌机绞制并加入辅料细斩为乳化肉糜，灌装入肠衣后入自动蒸煮烟熏箱蒸煮，蒸煮至肠体中心温度75 ℃，冷却后产品切片，真空包装并在4 ℃条件下低温冷藏.

1.2.3菌株的活化与保藏.

分别将单增李斯特菌(ATCC 19114、ATCC 19115、ATCC 19116及ATCC 19117)菌株的冻干粉于BHI液体培养基中活化(37 ℃，16～18 h)，后转至TSA平板上培养出单菌落(37 ℃，24 h)，并同时用MOX平板涂布检测其纯度，挑取TSB平板上生长的单菌落接种于斜面TSB培养基继续培养16～18 h，之后取出置于低温(4 ℃)条件下保藏备用.

1.2.4接种菌悬液的制备.

实验时，将斜面保藏的单增李斯特菌菌株用一定量的0.85%的生理盐水冲洗，之后各吸取1 mL该菌株的菌悬液配置成混合菌悬液，用涡旋混合器混匀，并计数.接种时，经梯度稀释使最终接种菌悬液的浓度调至约5 lg(CFU/g).

1.2.5接种、包装及贮藏.

将按“1.2.2”项下方式制得的低温鸡肉肠切片后，立即进行定量包装，25g/包，约4片，然后吸取250 μL菌悬液接种于切片两面(接触包装袋的一面除外)，使最终接种浓度约为2～3 lg(CFU/g)，最后将接种好的样本抽真空后置于7 ℃冷藏柜中贮藏.每组样本制备3份，每次每组抽取3个样本检测.

1.2.6指标检测.

1)单增李斯特菌的检测.将保藏于4 ℃条件下的样品捏碎，转移至无菌的均质袋中，加入225 mL无菌水，用均质器拍打5 min，使鸡肉肠中的单增李斯特菌充分的洗脱下来.检测时，使用0.85% NaCl和0.1%蛋白胨混合的蛋白胨水进行梯度稀释，选择合适的稀释度用移液枪吸取100 μL于MOX选择性培养基上，用涂布棒涂布均匀，37 ℃下培养48 h，对单增李斯特菌进行计数.

2)水分活度测定.水分活度测定参照GB/T 5009.238-2016《食品安全国家标准 食品水分活度的测定》方法，直接采用水分活度仪测定.

3)亚硝酸盐残留量测定.亚硝酸盐残留量测定参照GB 5009.33-2010《食品安全国家标准 食品中亚硝酸盐与硝酸盐的测定》方法，具体步骤为：取5 g匀浆样品加入12.5 mL饱和硼砂溶液，加入300 mL 、70 ℃水溶解，100 ℃水浴15 min后冷却至室温，加入5 mL亚铁氰化钾溶液，摇匀，再加入5 mL乙酸锌溶液后定容至500 mL，放置30 min后过滤，40 mL滤液于50 mL比色管中加入2 mL对氨基苯磺酸溶液，静置5 min后加入1 mL盐酸奈乙二胺溶液，加水至刻度，静置15 min后，于波长538 nm处测定吸光值.

4)食盐含量测定.食盐含量测定参照GB/T 5009.42-2016《食品安全国家标准 食盐指标的测定》方法，具体步骤为：称取25 g样品溶于500 mL水中，取25 mL滤液定溶于250 mL，再取25 mL混合液加入25 mL水后使用铬酸钾指示液进行硝酸银标准溶液滴定.

5)pH值测定.pH值测定方法为，取10 g样品加入90 mL蒸馏水(pH值为7.0)中，搅拌均匀后静置，插入电极带度数稳定后读取数值.pH计电极用4.0和7.0的磷酸盐缓冲液进行校正.

6)质构特性测定.质构实验参照文献[12]的方法，具体步骤为：选取低温鸡肉肠的中部进行测定，将其切割成3 cm高的柱体，以P/36R-圆柱形平底探头进行质构剖面分析(TPA)，测试前速率为2 mm/s，测试速率为1 mm/s，测试后速率为10 mm/s，压缩距离为15 mm，启动形式为auto-5 g，数据获取速率为200 pps，每个处理组样品测定3次，记录测试结果.以测试开始到结束的力变形曲线上最大峰值力值作为硬度指标，二次压缩和一次压缩高度之比为弹性指标.

2　结果与分析

2.1　天然植物提取物等抑菌剂对鸡肉肠单增李斯特菌的影响

各实验组单增李斯特菌检测结果见表3.

表3　各实验组单增李斯特菌生长菌落数lg(CFU/g)

数据显示，在前12 d贮藏期内，空白对照组C1中的单增李斯特菌增长了3.7 lg(CFU/g)，在第26 d达到8.7 lg(CFU/g)，贮藏期单增李斯特菌生长繁殖最快，与他添加有植物提取物或抑菌剂的组别呈现极显著性差异(P<0.01).添加“亚硝酸钠+SD4+异抗坏血酸钠"的C2组在53 d检测期内单增李斯特菌的增量至第6周增长无显著变化(P>0.05)，至第7周也上升甚微，为各组中抑菌效能最佳组别.

实验结果表明，添加了1%DV的T1组，在53 d的检测期内单增李斯特菌的增长量小于0.5 lg(CFU/g)，显示出其对单增李斯特菌具有显著(P<0.05)的抑菌效果；添加了0.5% CS+0.5% DV的T3组和添加0.6% T4NW S+0.5% CS的T2组，两者在53 d检测期内的单增李斯特菌增量分别为2.1 lg和1.3 lg(CFU/g)；而仅添加2 mg/kg Nisin的T4组中，单增李斯特菌在前19 d贮藏期的增长量为0.9 lg(CFU/g)，在第26 d检测时达到2.9 lg(CFU/g)，与其余各实验组比较生长繁殖较快，呈现显著性差异(P<0.05)，仅低于对照C1组；而在添加有1 mg/kg Nisin+0.5% DV的T5组中，整个检测期内(53 d)其单增李斯特菌增长量为2.1 lg(CFU/g)，相较于T4组虽然减少了Nisin的添加量，但由于加入了DV，不同组合间的协同效应也开始显现，其效果也远远优于单纯添加1 %DV 的T1组和只添加1 mg/kg Nisin的T4组.总体来看，对单增李斯特菌抑制效果最好的仍然是传统的“亚硝酸钠+SD4+异抗坏血酸钠"经典组合C2组，产品贮藏至第7周仍然只有3.7 lg(CFU/g)，抑菌效果能够完全替代其作用的是0.6% T4NW S+0.5% CS组合的T2组，其次是1.0% DV的T1组和0.5% CS+0.5% DV的T3组.只添加2 mg/kg Nisin的T4组对单增李斯特菌的抑制在添加有植物提取物的各组中效果最差，但仍然呈现对单增李斯特菌较好地抑制效应.有研究表明，Nisin单独使用时,对单增李斯特菌的最小抑菌浓度为200 μg /mL[13]，但并不是浓度越高抑菌效果越好，在达到一定浓度后，其效果逐步稳定在一定范围[14].

2.2　天然植物提取物等抑菌剂对鸡肉肠aw、NaCl、NaNO2等的影响

本实验中的鸡肉肠产品理化指标如表4所示.

表4　鸡肉肠理化指标测定结果

数据显示，实验各组pH 6.39～6.48，aw0.97～0.99，NaCl 1.75～1.89，未呈现显著差异(P>0.05).亚硝残留添加有“亚硝酸钠+SD4+异抗坏血酸钠"经典组合的C2组为58.61 mg/kg，其余各组为0.表明除C2组的亚硝残留外，添加物未对鸡肉肠产品理化指标产生影响.

2.3　天然植物提取物等抑菌剂对鸡肉肠pH值的影响

实验中，各组别鸡肉肠产品贮藏期pH值测定结果见表5.

表5　4 ℃条件下低温鸡肉肠样品pH值

表5数据显示，在样品贮藏的初期，各处理组样品的pH值均在6.22～6.45之间，随着贮藏时间的延长，各处理组样品中的pH值均呈现下降的趋势,其中不添加防腐抑菌剂的空白对照组下降最大，而添加了天然抑菌剂T4N和T10的组和空白处理组的下降趋势相近，添加T4N的组下降趋势甚至比空白处理组的下降趋势更加迅速.pH值下降相对较慢的是添加了传统化学防腐剂实验组和植物提取物的T10组和DV组，这2种抑菌剂均显示出可有效减缓低温鸡肉肠产品pH值的下降，DV组在产品贮藏的前期能有效减缓样品pH值的下降，但在第35 d之后，其作用有所减弱.

2.4　天然植物提取物等抑菌剂对鸡肉肠质构特性的影响

实验中，各组别鸡肉肠产品质构测定结果见表6.

表6　添加抑菌剂对低温鸡肉肠质构的影响

表6数据显示，在低温鸡肉肠产品贮藏初始，不同的防腐抑菌剂添加已对产品的质构特性产生了影响.与不添加抑菌剂的空白对照相比，天然抑菌剂T10、DV、以及T10+DV均在一定程度上提高了产品的硬度，但差异不是很显著(P<0.05)，而各组的弹性差异则不显著(P>0.05).

3　结　论

本研究选择T4NW S、DV和CS天然植物提取物来替代硝盐在肉制品中的抑菌作用，以低温鸡肉肠产品为对象，单增李斯特菌为靶向抑制菌株，通过微生物挑战实验(MCT)对其抑菌效能进行了分析，并与经典化学防腐剂组合(1.56 mg/kg亚硝酸钠+3.5% SD4+5.5 mg/kg异抗坏血酸钠)及乳酸链球菌素Nisin进行了比较.实验结果显示，对单增李斯特菌抑制效果最好的是传统的“亚硝酸钠+SD4+异抗坏血酸钠"经典组合，但植物提取物在不同程度上可替代硝盐显著的抑菌作用，能够完全替代其作用的是0.6% T4NW S+0.5% CS，其次是1.0% DV，以及0.5% CS+0.5% DV.尽管只添加2 mg/kg Nisin对单增李斯特菌的抑菌效果最差，但仍然呈现出较显著的抑制效应.不同提取物产品还显现出互作效应(栅栏效应)，例如1 mg/kg Nisin+0.5% DV的组合，抑菌效果就远远优于单独添加1.0% DV或2 mg/kg Nisin的产品.

进一步的产品特性分析显示，植物提取物可完全替代传统硝盐的发色作用，其中T10组呈现较佳色泽，其a*值甚至略高于添加硝盐组.同时，随着贮藏时间的延长，各组产品pH值均有所下降，但添加了植物提取物的产品下降度更低，尤其是DV和T10+DV组显著更佳.各组别aw、NaCl等无显著差异.NaNO2的残留，除添加了亚硝酸钠的产品接近60 mg/kg外，其余各组均未检出.硬度和弹性等的质构检测各组未呈现特别显著的差异.

鸡肉肠是典型的低温肉制品，贮运过程中单增李斯特菌的控制是低温肉制品面临的难题.为保证产品微生物稳定性和产品安全性，硝盐类添加剂的应用就显得特别重要，这对于绿色、有机产品的开发，以及推行清洁标签化，往往成为难以逾越的障碍，而替代硝盐的天然植物提取物的应用，为解决此难题提供了可能.