大肠杆菌质粒DNA提取方法的研究

李 恒

(宿州市环境监测站 安徽宿州 234000）

1 引言

目前常见的DNA的提取方法主要有煮沸法、碱裂解法等，并且通过去除蛋白质和RNA以达到纯化质粒DNA的目的，传统的实验室的方法是碱裂解法。

2 方法

2.1 煮沸法提取大肠杆菌质粒DNA

2.1.1 DNA提取方法

（1）在适当的含抗生素（比如：氯霉素等）的30mL LB培养基中接种单一的大肠杆菌菌落，振荡培养至对数生长晚期以250r/min培养12-16 h；（2）将10mL大肠杆菌培养液置入微量离心管中于4℃下以12000r/min离心9min，将未分离的菌液保存；（3）离心后的溶液弃去上清夜，倒置于吸水纸上，并用吸管除去培养液滴；（4）用 350μlSTET 重悬大肠杆菌沉淀；（5）加入 25μl新配制的溶菌酶溶液，盖上离心管盖，轻轻涡悬3s后，并置于沸水浴40s；（6）在室温下用微量离心机以12000r/min离心15 min，将上清夜倒于灭菌洁净试管中；（7）在上清液中加入40ul 2.5mol/L的乙酸钠（pH5.2）和420ul异丙醇，以沉淀核酸，振荡混匀溶液，并在室温下放置5min，在4℃下以10000r/min离心10min,回收沉淀的核酸；（8）倒置于纸巾上使其液体流尽，并用吸管除去液滴，之后用1ml 70%的乙醇漂洗核酸沉淀，离心除去上清液，并除去所有的乙醇液滴，敞口放置在室温下直到乙醇全部挥发，用50 μl含RNAseA的TE（pH8.0）溶解核酸，轻轻涡旋混匀。

2.1.2 琼脂糖凝胶电泳检测

上述的溶液与EB混合染色进行1%琼脂糖凝胶电泳，电泳后在紫外分析仪下观察，并且进行拍照检测。

2.2 碱裂解法提取大肠杆菌质粒DNA

2.2.1 DNA提取方法

（1）在适当的含抗生素的25mL LB培养基中接种单一的大肠杆菌菌落，振荡培养至对数生长晚期以250r/min培养12-16 h；（2）取4.5mL大肠杆菌菌液以12000r/min离心 9min，弃去上清夜，尽量弃去干净，可以用小的枪头移去；（3）再加入100 μl冰预冷溶液Ⅰ，利用涡悬振荡器振荡，从而使菌体充分，室温放置2min；（4）加入200μl新配置的溶液Ⅱ，轻轻将离心管上下颠倒5～7 次，混匀，室温放置下 2min；（5）加入 150 μl冰预冷的溶液Ⅲ，轻轻将离心管上下颠倒5～7次，直至白色的沉淀充分形成，冰上放置3分钟，以12000r/min离心5min；（6）转移上清，并加入两倍体积的95%乙醇，室温放置5min后，以12000r/min离心5min；弃去上清；用200μlTE溶解沉淀，加入150 μl 6mol/L NH4Ac(pH8.0)，充分混匀后冰上放置3分钟，以12000r/min离心5min；（7）弃去上清，并加入两倍体积的95%乙醇，室温放置5min后，以12000r/min离心5min；（8）弃去上清，沉淀用70%的无水乙醇洗涤；（9）离心除去上清液，并除去所有的乙醇液滴，敞口放置在室温下直到乙醇全部挥发，用50 μl含RNAseA的TE（pH8.0）溶解核酸，轻轻涡旋混匀。

2.2.2 琼脂糖凝胶电泳检测

上述的溶液与EB混合染色进行琼脂糖凝胶电泳，电泳后在紫外分析仪下观察，并且进行拍照，检测。

3 结果与讨论

3.1 煮沸法提取的大肠杆菌质粒DNA电泳结果

此图是煮沸法提取的大肠杆菌质粒DNA琼脂糖凝胶电泳图，这张图没有经过RNA酶的处理，从图中我们可以明显看出电泳结果条带太暗，也由此说明质粒DNA提取的浓度很低，煮沸法提取质粒DNA效果并不是很好，因为在煮沸的过程中限制酶并不会完全消失，质粒DNA会降解。

3.2 碱裂解法提取大肠杆菌质粒DNA

此图是碱裂解法提取大肠杆菌质粒DNA琼脂糖凝胶电泳图，这张图未经过RNA酶的处理，这张图我们可以明显的看到电泳结果条带比较亮，条带也很清晰，此法提取质粒DNA的效果比较好。在裂解过程中，大肠杆菌的蛋白质、破裂的细胞壁和变性的染色体会缠绕成比较大的复合物，此后被十二烷基硫酸盐包盖，钾离子取代钠离子复合物沉淀，能够实现很好的分离。

图3-1 煮沸法提取大肠杆菌质粒DNA琼脂糖凝胶电泳图

图3-2 碱裂解法提取大肠杆菌质粒DNA琼脂糖凝胶电泳图

结语

通过以上煮沸法，碱裂解法两种方法对大肠杆菌提取质粒DNA，进行跑电泳的结果看来碱裂解法提取大肠杆菌质粒DNA的亮带最为清晰，而煮沸法提取大肠杆菌质粒DNA的条带最暗。

[1]皱湘辉，庄东红，钟名其等.大肠杆菌质粒DNA不同提取方法的比较 [J].汕头大学学报，2003.5,18(2):20-21.

[2]朱玉贤,李毅.现代分子生物学.北京：高等教育出版社[M]，1997.