抗凝剂和缓冲液对血涂片染色的影响

李琛 李璐

524023 广东湛江，广东医科大学组胚教研室（李璐）

血液是流动于心血管内的液态组织，又称外周血。血涂片在临床检验和教学工作中应用广泛，特别是对各种血液病的诊断和治疗有很大价值。血细胞具有重要的生理功能，其形态结构和功能对指导疾病诊断具有重要意义，也是血细胞检测教学的重点［1］。为观察到染色效果好、结构清晰、层次分明、不易褪色的血涂片，笔者经过长期实验探索发现，在乙酸盐缓冲液（HAc-NaAc）中加入5%～10%瑞氏-吉姆萨复合染液制作的血涂片效果较满意，现报告如下。

1 材料与方法

1.1 试剂和仪器 医用干燥真空采血管、75%医用乙醇棉球（山东安捷高科消毒科技有限公司），抗凝剂、瑞氏-吉姆萨复合染液（珠海贝索生物技术有限公司），pH≈6.0乙酸盐缓冲液（天津光复精细化工研究所），无水乙醇（天津富宇精细化工有限公司），载玻片（江苏世泰实验器材有限公司），特种铅笔（中华牌），电热恒温鼓风干燥箱（DHG-9070A型上海精宏实验设备有限公司），显微镜（OLYMPUS CX22）。

1.2 载玻片的清洗 新的载玻片上常含有游离碱，表面附着菌丝，使用前常应用清洗液或10%盐酸浸泡24 h，然后用纯净水清洗干净。由于手指表面上的油脂会污染玻片表面，使用时应手持玻片边缘，切勿触及玻片表面，以保持玻片清洁、干燥、无油脂。血滴接触的边缘要平整光滑。

1.3 制备抗凝剂 ① 准确称取肝素钠1 g，加入到100 mL纯化水中充分溶解，得到抗凝剂母液。② 用纯化水稀释抗凝剂母液至0.5%的浓度。③ 用1 mL注射器吸取0.5%的抗凝剂母液0.2 mL，加入纯化水至1 mL，得到备烘抗凝剂稀释液。④ 将上述1 mL稀释后的抗凝剂平均滴加到10个经过无菌处理的5 mL注射器中，轻轻转动注射器使肝素钠均匀分布在管壁上，以便后续取血时起到更好的抗凝作用，避免因注射器内的肝素钠分布不均使局部凝固和红细胞严重变形。⑤ 将装有备用抗凝剂稀释液的5 mL注射器置于50 ℃电热恒温鼓风干燥箱中烘干［2］。

1.4 血涂片的制备

1.4.1 采血 用医用干燥真空采血管采集人外周静脉血标本2 mL，与烘干备用的抗凝剂5 mL充分混合，倒入青霉素小瓶中，贴好标签并分组，放入冰箱备用（最长可保存5 h，尽量在放进青霉素小瓶后立即采用普通手工推片法进行推片操作）。

1.4.2 推片 取黄豆大小的血标本滴于准备好的载玻片一端，用另一边缘光滑的载玻片作为推片，置于血滴边缘，使血滴沿推片散开。通常推片与载血片呈30°～ 45°平稳向前推动，血液即在载玻片上形成薄膜。推片时，血滴越大、角度越大、推片速度越快，则血膜越厚，反之血膜越薄。推好片后手持玻片轻轻挥动，迅速干燥血膜，因血液会向下流动，因此干燥好的玻片应直立放置于立式染色缸中，以避免血细胞皱缩和血膜中央的血细胞数量减少。

1.4.3 固定 血膜干燥呈白色，干燥后用无水乙醇固定10 min，血膜固定后可长期保持血细胞的完整性，避免细胞溶解收缩和破碎。注意要点：① 血膜若未干透，细胞未牢固附在载玻片上，在染色过程中容易脱落，因此血膜必须充分干燥。② 血膜未干时进行染色，血细胞易漂浮于染液中，并在冲洗过程中随染液一起冲走，从而使血细胞减少、变性，甚至无血细胞。③ 天气寒冷时，置于37 ℃电热恒温鼓风干燥箱中保温促干，避免细胞变形缩小。④ 固定液无水乙醇可用丙酮代替。

1.4.4 染色

1.4.4.1 传统方法 取固定好的血涂片，用特种铅笔在血膜两侧分别划2道直线，避免染液外溢。因体积大的细胞常在此出现，应保护尾部细胞。将血膜平放于染色架上，滴2～3滴瑞氏-吉姆萨复合染液在血膜上，染液覆盖血膜，染色1 min。滴加pH≈6.8磷酸盐缓冲液（KH2PO4-Na2HPO4）2 min，待与染液混合后再染5～10 min，然后从血涂片中间加入蒸馏水，使染液从玻片四周溢出，以减少杂质沉淀［3］。

1.4.4.2 改良法 染色步骤同传统方法，染色后浸泡于pH≈6.0的乙酸盐缓冲液中，并加入5%～10%的染液，1 min后在Ⅰ、Ⅱ道蒸馏水中快速摇晃2～3次，洗去染液和分色。

1.4.5 封固 经染色的血涂片完全干燥后，镜检淘汰染色过深或过浅、有染色颗粒、血细胞分布不均的废片。用中性树胶直接滴一小滴到涂片上经染色的血膜区域，用小镊子夹取盖玻片一边，将盖玻片轻轻加压盖上，盖玻片与载玻片紧紧粘牢。放于室内通风处，待树胶干燥后可长期保存。

2 结果

传统方法的染色时间为8～13 min，改良后方法的染色时间可缩短为2 min。血涂片外观呈舌状，有明显的头、体、尾分布，四周完整留有空隙，厚薄适宜，分布均匀，无空泡，染色呈淡琥珀色。显微镜低倍观察显示，细胞均匀，分散无层叠。高倍观察显示，红细胞呈橘红色圆盘状，无细胞核；白细胞胞核呈紫红色，染色质清楚，粗细松紧可辨；血小板为不规则细胞质小块，周边均匀呈浅蓝色，中央为细小的紫红色颗粒；中性粒细胞胞核呈紫蓝色，颗粒呈浅红色，形态多样；嗜酸粒细胞胞核呈紫蓝色，颗粒呈橘红色；嗜碱粒细胞胞核呈紫蓝色；淋巴细胞胞核呈蓝灰色，胞质呈淡蓝色；单核细胞胞核呈蓝紫色，胞质呈灰蓝色。

经显微镜观察，改良法获得的血涂片染色具有与传统方法相同的效果，染色仍清晰，且改良法的着色更稳定，更便于识别和比较细胞的变化。见图1。

图1 血涂片染色镜检情况

3 讨论

血细胞形态学检验是临床基础检验技术，其临床应用价值不可忽视，但通常情况下，检验人员会单纯依赖血液分析仪，而忽视了形态学检验，因此常导致误诊和漏诊［4］。血涂片镜检是指血液经推片、染色后，在光学显微镜下进行白细胞分类，红细胞、血小板形态观察以及寄生虫检查等，是血细胞形态学检查的基本方法［5］。取血标本时需使用抗凝剂肝素钠，肝素钠抗凝剂的主要成分为肝素，其实质属于含硫酸基团的黏多糖，能够加强抗凝血酶Ⅲ灭活丝氨酸蛋白酶的作用，从而阻止凝血酶形成，起到抗凝血酶和阻止血小板聚集等多种作用。肝素钠抗凝剂的使用范围较广泛，研究证实，肝素中所含直链阴离子黏多糖的长短不同，具有较强的负电荷作用，呈强酸性，能够有效地避开血液凝固［6］。制作血涂片时的用血量很少，加入抗凝剂的量要求非常精准，用量过多会破坏细胞的形态，尤其是红细胞，造成严重的细胞变形（呈锯齿状）；而用量偏少则达不到抗凝的效果。为简化临床采血操作，可在抗凝剂的剂量纠正公式基础上，改变为全血量＝抗凝剂使用量 /〔0.001 85×（100 －HCT）〕，将抗凝剂使用量0.2 mL代入上述公式，则全血量＝108.11/（100－HCT）。这样可根据HCT进行采血，不用再调整抗凝剂用量，直接抽取调整后的全血量加入抗凝管即可，极大地提高了可操作性［7］。

用无水乙醇固定干燥后的血膜，细胞溶胶状蛋白质脱水变性并凝聚成颗粒状、网状凝聚蛋白质，其次级键断裂离解，结构脂质溶脱，各种结构基团裸露，使复杂立体结构的凝聚蛋白质具有表面吸附能力，能够与染液中的色素分子发生物理化学性吸附而着色［8］。

血涂片染色一般采用瑞氏染色法和吉姆萨染色法。瑞氏染色法时间短，对细胞质和中性颗粒染色效果较好，但保存时间短。瑞氏染料中的酸性曙红（伊红）和亚甲基蓝（美蓝）为水溶性，适合在乙酸盐溶液中进行着染。将弱酸性乙酸盐溶液用于酸性染料施染属于安全染法，用于碱性染料施染能防止碱性对色光的危害，降低染料上染速率，提高匀染性，作为助溶剂能使染料溶解良好且稳定，还有利于蛋白质肽链上-NH3+和-COO-基团的电离。吉姆萨染色法易控制，对细胞核和疟原虫的染色效果较好，保存时间长，但染色时间长，价格高。改良瑞氏-吉姆萨复合染色法综合了上述两种方法的优点。染色后加入pH≈6.0的乙酸盐缓冲液洗染，与用磷酸盐缓冲液比较，减少了复染步骤，染色效果更好，作用更稳定，便于识别和比较细胞的变化，但由于缓冲液的pH值越高，会导致细胞质越不易着色，胞质、胞核对比效果差。

制备血涂片应厚薄适宜，头尾分明，边缘整齐，两侧应留有空隙，细胞分布均匀。血膜太薄会使白细胞多集中在边缘，血膜太厚会使细胞重叠缩小。血细胞分析仪虽极大地提高了血细胞分析的效率，但目前国内使用的三分类均根据白细胞体积的大小进行分类，不能完全识别原始幼稚细胞、异型淋巴细胞、嗜酸粒细胞、嗜碱粒细胞以及中性粒细胞毒性变，甚至将一些小粒细胞当作中间细胞，大淋巴细胞当作粒细胞，大片成簇的血小板当作白细胞。因此，血涂片镜检对细胞结构异常的检查效果明显优于血细胞分析仪，在常规镜检中仍占有重要地位。

形态学检验技术是多学科理论性和实践性密切结合的技术，形态学检验专业人员应具有较为全面的临床医学、检验医学和有关边缘学科的知识，具有扎实的检验技术基本功以及较高的素质。从事形态学检验的人员还应接受正规培圳，相关科室建立形态学结果报告的评价认可制度，制定各种染色方法的质量控制标准，遵循阅片流程，充分发挥阅片者的主观能动性。同时阅片者还要有高度负责的态度，不放过细胞形态中的任何成分。只有如此才能不断提高检验人员的综合素质，为临床诊断和治疗提供科学依据［9］。

1 张立新，尚宏伟，路欣，等.血涂片制作与观察在医学形态学实验教学中的应用［J］.中国医学装备，2013，10（9）：37-38.

2 廖秋萍，井波，安济山，等.实验教学中血涂片抗凝剂的制备和使用方法［J］.黑龙江畜牧兽医，2017，14（14）：114-115.

3 李璐 .血涂片染色方法的改良［J］.华夏医学，2011，24（3）：351-352.

4 石红梅.浅谈血细胞形态在疾病诊断中的重要性［J］.实用检验医师杂志，2012，4（4）：256-258.

5 张方锦，刘爱民，林茂阳.血涂片镜检在血常规检验中的重要作用［J］.世界最新医学信息文摘，2017，17（82）：130-131.

6 王艳艳.药物对常用临床生化检验指标结果的影响及对策［J］.中国实用医药，2016，11（5）：122-123.

7 娄峻，王森钰，邱卫强.抗凝剂校正公式在凝血四项检测中的应用［J］.实用检验医师杂志，2014，6（3）：189-191.

8 刘志兰，杨彬，赵宝忠.血细胞涂片瑞氏染色法缓冲液的选择［J］.临床检验杂志，2011，29（4）：252-253.

9 赵先进，李秀梅，孙磊.做好显微镜形态学室间质评的体会与思考［J］.实用检验医师杂志，2011，3（1）：58-59.