不同抗凝剂对黄鳝外周血抗凝效果的比较研究

陈 璇，陈志永，徐 敏，范玉顶，刘泽军，夏中曦，刘 彧，隗黎丽，钟其旺

(1.江西农业大学生物科学与工程学院，南昌 330045； 2.中国水产科学研究院长江水产研究所，武汉 430223)

鱼类的血液在物质运输、免疫防御、体液调节和维持内环境的稳态中起着重要作用，因此鱼类的血液学研究一直倍受关注。血液学的研究内容主要包括血细胞指标[1-3]、生理生化指标[4-6]、免疫指标[7-9]和基因表达[10-11]等。由于大多数血液学参数的测定都需要在血液未凝集的状态下进行，因此抗凝剂是血液学研究中的常用试剂。目前，鱼类中抗凝剂使用主要参照人血中的使用标准。常见的抗凝剂主要有ACD[12-13]、EDTA[14]、肝素[8，15]、草酸钾[16]、草酸盐[17]、柠檬酸钠[18]，不同抗凝剂的抗凝机制各不相同，例如，肝素通过特异的戊糖序列与抗凝血酶Ⅲ(ATⅢ)结合，加强了ATⅢ对凝血因子FXa 和FⅡa 等的抑制作用，从而发挥抗凝作用[19]；ACD、EDTA、柠檬酸钠、草酸钾和草酸盐则是通过与血液中钙离子以不同的形式结合，降低钙离子浓度，从而达到抗凝效果。然而抗凝剂的选用不当可能会对一些实验结果造成较大的干扰[20]，所以在血液学实验中选择合适的抗凝剂及合适的抗凝剂浓度是至关重要的。近年来只有少量研究关注鱼类血液抗凝剂的选用[16，21]，大多数鱼类中都缺乏相应的选用标准，这极大地阻碍了鱼类血液学的研究进程。本文以黄鳝的外周血为研究对象，通过比较6种常用的抗凝剂在不同浓度和作用时间下的抗凝效果以及对血细胞存活率和总DNA含量的影响，以确定黄鳝血液学研究中所需的最优抗凝剂及其有效浓度，并为其他鱼类血液抗凝剂的选用提供参考。

1 材料和方法

1.1 材料

乙二胺四乙酸二钠(EDTA)、肝素、氯化钠、柠檬酸、柠檬酸钠、葡萄糖、草酸铵、草酸钾，以上所有试剂均为分析纯(国药集团)。台盼蓝染色液，北京索莱宝科技有限公司生产。黄鳝取自江西洪瑞黄鳝养殖场，鱼体健康，体表无伤痕，体重为30～35 g。

1.2 方法

1.2.1 不同浓度的抗凝剂配制

本研究采用的6种抗凝剂分别为肝素、EDTA、柠檬酸钠、草酸钾、草酸盐、ACD。以0.8 %生理盐水作为溶剂配制各种抗凝剂的母液，肝素(0.063%)、EDTA(4%)、柠檬酸钠(16%)、草酸钾(10%)、草酸盐(4×：草酸铵48 g/L、草酸钾32 g/L)和ACD(4×：柠檬酸19.2 g/L、柠檬酸钠52.8 g/L、葡萄糖58.8 g/L)，4 ℃中保存，使用时用0.8 %生理盐水进行梯度稀释。

1.2.2 不同抗凝剂抗凝浓度的确定

用1 mL的无菌注射器从黄鳝的尾静脉采血800 μL，分别取18 μL全血与2 μL各梯度浓度的抗凝剂进行混匀，作为实验组；另取18 μL全血与2 μL生理盐水混匀，作为对照组。混合后的血样于25 ℃中放置1 h、6 h、12 h和24 h后取出，观察是否出现凝集成块的现象。以上实验重复三次。

1.2.3 不同抗凝剂对血细胞的影响及最佳抗凝浓度的确定

用1 mL的无菌注射器从黄鳝的尾静脉采血，分别取18 μL全血与2 μL各梯度浓度的抗凝剂混匀，作为实验组；另取18 μL全血与2 μL生理盐水混匀，作为对照组。于4 ℃中放置1 h和24 h后，加入0.4 %台盼蓝溶液2.5 μL混匀，室温静置2～3 min后镜检计数。分别记录不同抗凝剂内5个视野中活细胞的数量和死亡细胞的数量，以血细胞的死亡率作为标准，确定其有效浓度。实验进行五次独立重复。

细胞死亡率(%)=死细胞总数/(活细胞总数+死细胞总数)×100%

1.2.4 不同抗凝剂对血液中总DNA含量的影响

分别取45 μL全血与5 μL最佳抗凝浓度的抗凝剂进行混匀(终浓度：ACD：0.10×；EDTA：0.50‰：肝素：0.016‰；草酸钾：0.63‰；草酸盐：0.025×；柠檬酸钠：8.00‰)，作为实验组，于4 ℃中放置0、1、3和7 d后，分别混匀取血10 μL进行基因组DNA的抽提。对照组为9 μL全血与1 μL生理盐水混匀后立即进行DNA的抽提。基因组DNA的抽提采用酚氯仿抽提法进行，将抽提得到的DNA溶解于200 μL无菌去离子水中。用ThermoNanoDrop 2000超微量分光光度计对DNA的浓度和质量进行检测。每种抗凝剂重复实验三次。

1.3 数据处理和分析

所得数据用Excle 2007进行整理，运用SPSS 17.0软件进行数据分析，采用Origin 7.5进行作图。

2 结果

2.1 不同抗凝剂的抗凝浓度

在生理盐水对照组中，所有血液样本均在1 h内出现凝血现象。在实验组中，不同抗凝剂均展现了良好的抗凝效果，但不同抗凝剂的抗凝浓度各不相同。如表1所示，当ACD、EDTA、肝素、草酸钾、草酸盐和柠檬酸钠的终浓度分别为0.025～0.40×、0.25～4.00‰、0.004 - 0.063‰、0.63～ 10.00‰、0.025 ～0.40×、1.00 ～16.00‰时，在24 h内均能有效抗凝。

注：“+”表示血液凝固；“-”表示血液未凝固。

2.2 不同浓度抗凝剂对血细胞死亡的影响

显微观察时，死亡的血细胞在台盼蓝染色后呈蓝色，出现细胞核变大、胞质减少的现象，而活细胞则呈无色透明状。实验结果表明当抗凝剂的浓度过高或过低时，均导致血细胞死亡率的上升，且随着放置时间的延长，血细胞的死亡率呈现出不同程度的增加(表2)。通过对24 h内血细胞死亡率的统计分析发现，ACD、EDTA、肝素、草酸钾、草酸盐和柠檬酸钠的最佳抗凝终浓度分别为0.10×、0.50‰、0.016‰、0.63‰、0.025×和8.00‰，其血细胞死亡率最低，分别为(1.87±1.55)%、(1.36±0.64)%、(1.55±0.69)%、(1.08±0.48)%、(1.62±0.53)%和(0.90±0.41)%，方差分析显示最佳抗凝浓度下的六种抗凝剂在24 h的血细胞死亡率无显著性差异(P>0.05，数据未显示)。对照组血液于1 h内出现凝固现象，故未进行死亡率的测定。

表2 各种抗凝剂中黄鳝外周血血细胞的死亡率

注：表中不同字母表示在同一时间下同一种抗凝剂中各处理浓度间存在显著性差异(P<0.05)；“*”表示同一种抗凝剂中不同时间点间细胞死亡率存在显著差异(P<0.05)。

2.3 不同抗凝剂对血液中总DNA提取的影响

六种抗凝剂在最佳抗凝浓度下均具有良好的抗凝效果，7天内均未出现凝血现象。通过酚氯仿抽提法获得的DNA经质检，发现质量良好，电泳检测未发现明显降解，且OD260/280=1.78-1.83，OD260/230=2.38-2.44，表明各种抗凝剂对血液DNA的提取质量无明显影响。但是，通过比较不同时间点各抗凝组与对照组的DNA含量发现，取血后立即抽提时(图1，0 day)，实验组与对照组间无显著差异。但随着放置时间的延长，实验组中外周血的DNA总量都出现了不同程度的下降。其中，草酸钾和草酸盐组中DNA量在第一天开始出现显著下降(P<0.05)；ACD、EDTA和柠檬酸钠组中DNA量在第7天才开始出现显著下降(P<0.05)；而肝素组中DNA含量虽有下降，但并不显著(P>0.05)。

图1 不同抗凝剂对黄鳝外周血DNA含量的影响Fig.1 Effects of different anticoagulants on contents of peripheral blood DNA

ACD：0.10×；EDTA：0.50‰：肝素：0.016‰；草酸钾：0.63‰；草酸盐：0.025×；柠檬酸钠：8.00‰。图中不同字母表示同一抗凝剂各处理间在P<0.05水平上差异显著。

3 讨论

本研究表明一定浓度的6种抗凝剂对黄鳝外周血均能产生良好的抗凝作用，这与此前在鲤中的研究结果一致[16]。虽然人血中的常用浓度也能使黄鳝外周血产生抗凝效果，但其与黄鳝中的最低抗凝浓度间仍具有一定差异，推测可能是由于两者凝血机制的不同导致，例如，血小板膜磷脂的转运在哺乳动物的凝血中是必不可少的过程，但鱼类在不含有血小板膜磷脂的情况下仍能发生凝血过程[22]。

通过对不同浓度抗凝剂进行的血细胞死亡率的统计发现，过高或者过低的抗凝剂浓度均会增加血细胞的死亡率。当抗凝剂浓度过低时，可能会导致抗凝不彻底，产生肉眼无法辨别体积很小的血凝块[23]。当抗凝剂浓度过高时，可能会导致血细胞可能处于高渗的状况中，并进一步造成血细胞的死亡[24]，这表明渗透压可能也是抗凝剂影响血细胞存活率的一个重要因素。另一方面，当抗凝剂的浓度过高时，可能会对血细胞产生一定的毒性作用。目前，鱼类血液学研究中常用的抗凝剂为0.1 %肝素[5,9,25]，而本实验的结果表明肝素的最低抗凝浓度和最佳抗凝浓度分别为0.004‰ 和0.016‰，远低于通常的使用浓度0.1 %。若在黄鳝外周血中以0.1 %的肝素进行抗凝，可能会由于使用的抗凝剂浓度偏高，导致血细胞产生较高的死亡率。除肝素外，ACD、EDTA、草酸钾和草酸盐的最佳抗凝浓度也低于人血中的使用浓度，而柠檬酸钠在黄鳝外周血中的最佳抗凝浓度则高于人血中的使用浓度，这说明人血中的抗凝剂标准在鱼类中一致性较差，鱼类抗凝剂的使用仍需建立相应的标准。

由于血液取材的便利性和连续监测的可能性，所以血液是基因组获取和基因检测的良好材料。在麦穗鱼(Pseudorasboraparva)和黄颡鱼(Pelteobagrusfulvidraco)中，相较于其他组织，血液抽提获得的DNA含量相对较高[26-27]。通过比较六种抗凝剂对黄鳝血液DNA抽提的影响，表明血液提取的基因组DNA质量良好，且9 μL全血抽提获得DNA含量高达21.32 μg。同时，不同抗凝剂的短暂处理对DNA的质量影响不大，但经低温保存一段时间后，抽提获得的DNA含量均出现了不同程度的下降，含有ACD和EDTA的血液中DNA的含量下降最多，其次是草酸盐、草酸钾和柠檬酸钠；而加入了肝素的血液中DNA的稳定性最高，含量无显著下降。这与之前关于冷冻保存的ACD和EDTA抗凝血DNA含量下降的报道吻合[13]。同时，在新疆卡拉库尔羊中也发现肝素和柠檬酸钠抗凝血中DNA的稳定性较好[28]。尽管肝素抗凝血中DNA的稳定性最佳，但由于肝素对DNA聚合酶具有较强的亲和力，会抑制PCR反应[29]，故不建议在分子实验中使用。

4 结论

综上所述，6种常见抗凝剂在黄鳝外周血中均能获得良好的抗凝效果，且当ACD、EDTA、肝素、草酸钾、草酸盐和柠檬酸钠的终浓度分别为0.10×、0.50‰、0.016‰、0.63‰、0.025×和8.00‰时，对血细胞影响最小、抗凝效果最佳。肝素在六种抗凝剂中是血液提取基因组DNA的最适抗凝剂，但不推荐用于设有PCR反应的实验中；若保存的血样后续需要进行PCR扩增，更推荐使用草酸盐或柠檬酸钠进行抗凝。