基因诊断中测序技术的应用及优缺点

陈跃龙

基因测序技术已广泛应用于分子生物学和基础医学领域。本文主要介绍了第一、二、三代测序技术的优缺点，第三代测序技术在生物医学领域的应用，以及第四代测序技术的研究进展。基因组携带个体的所有遗传信息，基因测序可以加深对疾病特别是恶性肿瘤分子机制的认识，在诊断和治疗中发挥重要作用。

测序技术在基因诊断中的应用

运用第一代的测序技术，不管是Sanger双脱氧链终止法，还是Maxam和Gilbert化学裂解法，都需要放射性同位素标记，操作复杂，自动化程度低，不能满足基因大规模测序的要求。而在实践中，毛细管阵列DNA测序时间长、成本高，不能满足基因组学发展的需要。

单分子DNA测序。第三代测序技术是在单细胞和单分子水平上进行基因组测序的新技术。2007年以来，DNA平台已被广泛使用。同时，人类单体型项目、人类基因组计划1000和癌症基因组计划等重大国际合作项目也日益成为基因组研究的顶峰。所有的材料都进行了测序，并且是与DNA混合的大量细胞样品。这些材料不能满足微生物生态学、肿瘤基因组学、法医学，微观诊断和遗传印记研究领域的要求。第三代测序技术以实时测序和纳米多孔单层技术为标志，为解决这些问题打开了新的门户。

不像NGS依靠DNA模板对PCR扩增来结合固体表面，然后合成并测序，第三代测序是单分子测序，不需要进行PCR的扩增。第三代基因测序技术中有三种主要类型：单一测序、单链Helico测序技术和单个纳米粒子测序技术等。

SMRT测序原理。使用荧光标记的DNA在显微镜下实时记录荧光强度的变化。荧光标记的DNA结合DNA链，同时检测DNA链中的荧光，当它与DNA链形成化学键时，荧光团DNA聚合酶被去除。荧光DNA不影响DNA聚合酶的活性，DNA链的荧光自然与DNA链相同。

牛津纳米棒单分子测序原理：生物纳米孔由α-溶血素构成，外溶酶附着在底部孔的外表面。环糊精的共价合成连接到嵌入脂质双层中的孔的内表面。预处理不同的盐浓度应该基于两个脂质双层。在适当的电压下，单链DNA被切割并且单链DNA进入孔中，与孔中的环糊精瞬时反应。这会影响通过毛孔的原始电流。

腺嘌呤与胸腺嘧啶（T）和胸腺嘧啶（T）相似，但与其他核苷酸相比，T在环糊精中的滞留时间为3倍。胞嘧啶（G）和停留时间也不同。因此，每个基因和当前的干扰幅度是唯一的。此外，由于C-甲基化在环糊精中的停留时间大约为正常C停留时间的2倍之久，所以C-纳米孔单分子序列的甲基化可以以99.9%的准确度直接读出，而无需重复测序孔快速去除。

测序技术的发展及其优缺点

DNA测序是基因诊断史上具有里程碑意义和划时代意义的技术革命，被称为基因诊断的黄金标准。桑格在1977年发明了基因测序技术以来，基因测序技术诞生已经有40多年，它广泛应用于遗传病的基因诊断和产前/植入前诊断，特别是单基因疾病。2007年，罗氏公司伊利米纳公司和ABI公司发明了高通量测序技术，即下一代測序技术。然而，测序技术的发展至今仍未停止，以单分子实时测序和纳米孔技术为标志的第三代测序新产品也进入了历史阶段。

优点。（1）DNA聚合酶的反应迅速，能较好地实现基本的测序技术，可在1秒内测量10个核苷酸。测序速度为化学测序的速度的二万倍。（2）DNA聚合酶反应具有持续性，可以进行长时间的基因测序，这种技术可以用来测量数千个碱基。高精度，高达99.999999%。这将大大减少体外转录。（3）基因聚合酶能够测出不同基因序列，基于时间差异，可以确定模板C是否被甲基化。可以获得许多重要的突变，节省项目成本。（4）挖掘DNA突变和来源的频率，验证率很高。（5）基因测序技术能够有效的预防癌症的发生。（6）区分正常和癌症遗传变异水平。（7）基因组测序，因为它读取时间长，可以精确预测癌细胞的减少数量。在基因组测序中，重叠群测序重叠群（重叠后）显着减少了随后的基因组装配和注释的工作量，节省了大量时间。它比NGS快得多。因此，基因组测序和表征被广泛用于细菌和病原体。单分子测序的优点在突变或SNP鉴定的病理学检测中是无与伦比的。没有PCR扩增步骤，扩增过程中的基本错误没有出现这种优势。允许它以特定的顺序检测SNP。产前诊断中的突变和罕见频率测定在植入前基因诊断中具有独特优势。（8）除了具有一定程度的组织和分化的人类和小鼠细胞的基因组测序外，它们也适用于各种细胞类型。对单细胞如肿瘤细胞、干细胞、循环肿瘤细胞、单个生殖细胞，胚胎细胞以及细胞（神经，表皮等）进行第三代测序。测序技术具有高通量测序，长读数时间短，成本低，测序时间短，初始剂量少，检测精度高，即使变化小。

缺点。为了使基本测序技术更好地适用于基因的自动化识别、优质的基因测序，因此不适合单基因的检测，例如需要单基因疾病，则检测结果不太准确。另外，尽管第三代测序技术还不够先进，但仍然需要的酶（或核酸聚合酶）以及如何保持其活性和稳定性仍然是一个重要问题。对于太平洋生物科学技术的优化升级，可以通过提高单基因的测序结果，来进一步完善生物科学技术的检测升级。但是，仍然需要降低背景噪音和DNA速度控制。另外，如何在DNA固定的前提下解决和提高DNA分子结构的延展性。

总结与建议

近年来，基因测序技术发展迅速。虽然第一代测序技术在各种检测平台上仍然十分活跃，但第二代和第三代测序器相继出现，第四代测序技术日趋完善。第一代至第四代测序技术有其优缺点。（1）第一代Sanger测序技术具有成本高、吞吐量低、读取长度长、精度高等优点。对于较小的样本，排序仍然是最好的选择。（2）第二代测序技术发展迅速，产量高、成本低，已被广泛应用于大规模测序。但第二代测序技术的主要缺点是阅读长度相对较短。（3）第三代测序技术不仅增加了阅读长度，而且直接检测RNA序列和甲基化序列。第三代测序技术仍在发展中。其中，离子流测序库的制备过程繁琐，读取长度不足，SMRT测序技术的有效响应孔数不足，原始测序数据的准确性不高。（4）第四代测序技术是以第三代测序技术为基础的。与前三代相比，具有代表性的纳米孔测序技术在成本和速度上都有了很大的提高，仪器也越来越小型化。基因测序技术是人类探索生命奥秘的重要手段之一。它在生命科学和生物医学的发展中发挥了巨大的作用。尽管最先进的纳米级技术已经取得了许多进展，但它仍然面临着许多挑战。例如，DNA控制和纳米孔制造仍处于实验室阶段.。我们有理由相信，新一代测序技术的困难将逐步克服，在基因测序的指导下对遗传病的诊断和治疗。精确化的基因治疗能取得更好的临床疗效，基因测序技术将对未来人类健康产生重大影响。