高效液相色谱法亲水作用模式在亲水化合物分析中的应用研究

宣园园

在一般高校药学与化工类仪器设施分析教育中，HPLC占有很大地位，这得益于于其在研究方面得到的广泛应用效果。在传统教学过程，会把HPLC法分成正反相以及离子对色谱法，能够用来研究极性非极性、酸碱性等各种特性的亲水物。实验课程一般也围绕这几点选择常用的亲水物，该方式在药物分析方面，使用的很少，还未引起足够重视，本文对此展开了简要分析。

仪器和试剂

仪器。Waterse2695液相sep设备并搭配2998pad测试仪，merck色辅助和电子天平秤。

试剂。胞嘧啶；乙腈是色谱级醋酸氨是分析纯。

方法和结果

分析条件。流动相：- 0.01mol/L含量的乙腈醋酸氨液体，测量波长为 254纳米，流速为每分钟 0.8毫升，柱温是 30摄氏度，样本体积20μL。流动相通过 0.45μm小口滤膜过滤后应用。

（1）供试品液体。采集样本25毫克，放于50毫升容器内，通过流动相超声分解，并稀释到刻度处，然后摇晃均匀。

（2）对比液体。采集供试品液体1毫升，放于100毫升容器内，通过流动相稀释到刻度处，然后摇晃均匀，接着量取5毫升，放于50毫升容器内，通过流动相超声分解，并稀释到刻度处，然后摇晃均匀。

系统有效性测试。量取胞嘧啶对比品与尿嘧啶对比品分别5毫克，放于10毫升容器内，通过流动相稀释到刻度处，摇晃均匀，采集20μL引入色谱仪。此外，采集对比液体，反复检测五次，保存色谱图。结果显示，胞嘧啶和尿嘧啶主峰的脱离度是14.8，满足要求。胞嘧啶主峰存留时间的RSD%是0.21%，峰范围的RSD%是0.61%，平均理论板数超过12422，平均拖尾因子是1.14，色谱环境稳定，精密性优良。

专属性测试。利用DAD测量仪，分别观察了空白溶剂与供试品液体，在胞嘧啶主峰存留时间处190- 400纳米范围之内紫外光谱图形，结果显示，胞嘧啶基本杂质和主峰彻底脱离，分离度超过1.6，胞嘧啶主峰纯度方向低于纯度阈值，表示该方式的专属性很好。

讨论

测量波长的选取。精准采集供试品液体20μL置于液性色谱器内，使用DAD测量仪在190- 400nm之内进行扫描，结果显示，胞嘧啶在250- 266納米之内有很大吸收，于254纳米波长周边吸取曲线改变比较平缓，根据其相关物质的吸取波长，所以选取254nm用来测试波长。

流动相选取。HILIC分析柱一般在硅胶或是聚合物前提下，键合中性基团，弱离子转换，两性离子等各种固定相，文章采取硅胶结合两性离子，存留机制包含分析物和固定相表示亲水层的配置功能及与固定相电荷的效应，所以对亲水化合物与极性化合物的存留性质及反向分析柱大体相反。理论上，甲醛也能用来脱离亲水分析柱，但甲醛存在的极性远远超过乙腈，在HILIC柱表面具有较强的洗脱水平，让亲水物，在柱表面的容量因子减小，不利于脱离，所以，本文选取乙腈观察，并完善流动相的基本参数。实验得知，伴随流出液含量的增加，胞嘧啶存留时间随之缩减，杂质之间的脱离度不断降低，分析其原因可能是由于高盐含量会削减固定相电荷和亲水物的相互作用导致亲水物的保留降低。HILIC柱和正向分析柱雷同，有机相比重增加，亲水物保留时间增多，通常有机相比重，在保证在40- 95%之内最佳，太高会影响固定相物质的湿润度和极性基团拓展，从而影响研究的重现性，太低就会导致极性基团的水解让固定相丧失，降低色谱柱应用性能。通过测试，得知乙腈比重在80-90%范围之内，胞嘧啶主峰存留时间为最佳，流速和柱温的干扰与常规反相色谱柱相同，只是0.6毫米内径的HILIC柱的最好流速为每分钟0.5毫升，而以往反相色谱柱为每分钟1毫升，统一分析时间与分离效果，流速确定为每分钟0.8毫升。