固相萃取结合气相色谱-三重四极杆质谱法测定高酸水果中48种农药残留

张博伦，庞国芳，冯 春，李建勋，吴兴强，胡雪艳，范春林*

(1.北京工商大学 食品学院，北京 100048；2.中国检验检疫科学研究院，北京 100176；3.河北大学 化学与环境科学学院，河北 保定 071002)

柚子、橙子、菠萝、山楂等具有较强酸性口感的水果含有丰富的可溶性固形物、维生素C，并具有气味芬芳、口感独特、益于身体健康等特点，成为广受欢迎的水果。这类pH<3.5的水果通常被称为高酸水果，其富含的果酸能够预防心血管疾病、促进人体新陈代谢、改善人体酸碱平衡[1]。然而在水果种植和储藏过程中，广泛使用了各类农药[2-4]。超标的农药残留会对人体造成伤害，对生态环境也造成不利影响[5-6]。

目前对于水果中农药残留量的主要检测方法有气相色谱法(GC)[7-9]、高效液相色谱法(HPLC)[10-11]及色谱-质谱联用法[12-13]。由于水果种类多、基质复杂，存在大量干扰因素，而且高酸水果含有较多的果酸及风味物质，对其农残检测带来了较大困难[14]。为了得到准确的检测结果，样品前处理方法的优化尤为重要。目前，水果样品的前处理方法有固相萃取法(SPE)[15]、QuEChERS法[16]、固相微萃取法(SPME)[17]、基质固相分散法(MSPD)[18]、液液萃取法(LLE)[19]和超声辅助提取法[20]。固相萃取法是利用选择性吸附和选择性洗脱的原理，通过使用萃取柱在保留被检测物质的同时去除杂质，再洗脱被检测物质，以达到快速分离净化与浓缩的目的，降低了样品基质的干扰，提高了检测灵敏度。

日常分析中发现，以GB 23200.8-2016为代表的广适方法在对高酸水果进行检测时，加标回收实验结果与其他果蔬相比较差。本文根据GB 2763-2016中规定的食品中农药最大残留限量(MRL)，结合日常检验工作中的常检农药，选取48种具有代表性的农药作为研究对象，将固相萃取法与GC-MS/MS结合并进行优化后，用于高酸水果基质中的农残检测，结果满意。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

Agilent 7890A-7000气相色谱-三重四极杆质谱仪(美国Agilent公司)，配7693A自动液体进样器；KDC-40低速离心机(中国中佳公司)；AH-30全自动均质仪(睿科仪器有限公司)；Rotavapor R-215旋转蒸发仪(Bucci公司)；N-EVAP 112型氮吹浓缩仪(美国Organomation Associates公司)；SR-2DS水平振荡器(日本Taitec公司)；MX-S涡旋搅拌器(美国Scilogex公司)；KQ-600B型超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；PL602电子天平(瑞士Mettler-Toledo公司)；Milli-Q超纯水仪(Millipore公司)。

48种农药标准品(纯度≥95%)及内标环氧七氯均购自德国Dr.Ehrenstorfer公司；乙腈、甲醇、正己烷(美国Honeywell公司)和甲苯(美国Fisher公司)均为色谱纯；SPE柱(Sep-Pak Vac 6cc CarbonNH2Cartridges，美国Waters公司)；氨基净化柱(ProElutNH21 000 mg/6 mg，北京Dikma公司)；其他未作特殊说明的试剂均为分析纯。水果购于当地超市。

1.2 实验方法

1.2.1色谱-质谱条件色谱柱：Agilent DB-1701(30 m×250 μm×0.25 μm)；恒流模式流速：0.88 mL/min；载气：高纯氦气(99.999%)；碰撞气：高纯氮气(99.999%)；进样口温度：250 ℃；进样量：1 μL；进样方式：不分流；溶剂延迟：6 min；EI离子源温度：230 ℃；EI源能量：70 eV；四极杆温度：150 ℃；传输线温度：280 ℃；色谱柱升温步骤：初始温度40 ℃保持1 min，以30 ℃/min升至130 ℃，再以5 ℃/min升至250 ℃，最后以10 ℃/min升至300 ℃，保持5 min；扫描模式：MRM多重反应监测，分为5段：7.00～18.60 min、18.60～22.50 min、22.50～26.00 min、26.00～28.90 min、28.90～38.00 min。

1.2.2样品的制备柚子、橙子、菠萝样品放入打浆机内打碎，山楂去核后打碎。将打碎后的样品装入小瓶后加盖、密封，-18 ℃低温保存。使用前再恢复至室温。

1.2.3标准品溶液的配制准确称取10 mg标准品于10 mL棕色容量瓶内，用甲醇溶解并定容。得到每种标准品的单一标准液后，混合配制成10 mg/L混合标准液。将混合标准液按实验所需的检测浓度逐级稀释，低温保存。内标溶液为100 μg/L环氧七氯甲醇溶液。

1.2.4化合物MRM方法的建立对2 mg/L农药标准液在m/z50～550范围内进行SCAN全扫描，根据得出的色谱图及全扫描谱图，确定每种农药的保留时间，以质荷比较大、丰度较高的特征离子作为MRM前级离子。用前级离子信息建立子离子扫描模式的方法，使碰撞电压在5～40 eV间每隔5 eV进行1次碰撞。每种碰撞能下根据谱图选出丰度较高的两个特征产物离子作为MRM的子离子。两个子离子中丰度较高的用于定量分析，另一个用于定性分析。

1.2.5固相萃取前处理过程称取10.0 g水果样品(精确至0.01 g)于100 mL离心管中，加入40 mL含1%(体积分数)醋酸的乙腈提取液，10 000 r/min均质1 min。加入4 g无水硫酸镁和1 g氯化钠，振荡5 min，于4 200 r/min离心5 min后，取20 mL上清液于150 mL鸡心瓶中，40 ℃水浴加热旋转蒸发至约2 mL，待净化。SPE净化柱内加入高约1 cm的无水硫酸钠，用5 mL乙腈-甲苯(体积比3∶1，下同)预洗SPE净化柱，同时轻敲净化柱排出柱内气泡，弃去下方流出液。待液面略高于硫酸钠顶部时，将浓缩液转入净化柱，下接50 mL鸡心瓶。用2 mL乙腈-甲苯(3∶1)冲洗鸡心瓶，将洗涤液转移至净化柱内，重复3次。柱上接25 mL储液器，以25 mL乙腈-甲苯(3∶1)洗脱。收集完毕后旋转蒸发至约0.5 mL，氮吹至近干，加入1 mL正己烷定容，超声溶解后经0.22 μm尼龙膜过滤，供GC-MS/MS检测。

2 结果与讨论

2.1 质谱条件的优化

将各农药储备液稀释至2 mg/L，分别进行一级质谱扫描，确定各农药的特征离子和最优的碰撞电压。各农药的保留时间及其他离子信息见表1，总离子流图(TIC)见图1。

表1 48种农药的保留时间(RT)、离子信息、碰撞能(CE)、线性方程、相关系数(r2)、检出限及定量下限Table 1 Retention times(RT),ion pair information,collision energy(CE),linear equations,correlation coefficients(r2),limits of detection(LODs) and limits of quantitation(LOQs) for 48 pesticides

(续表1)

No．CompoundRT(min)Quantifiertransition(CE/V)Qualifiertransition(CE/V)Linearequationr2LOD(μg/kg)LOQ(μg/kg)38Tebufenpyrad(吡螨胺)29 23333 0/171 0(15)333 0/276 0(5)y=1 27x0 99920 51 039Endosulfansulfate(硫丹硫酸酯)29 43271 9/237 0(15)387 0/253 0(5)y=10 62x-0 130 99781 55 040Fenpropathrin(甲氰菊酯)29 83265 0/210 0(10)265 0/89 0(10)y=6 24x-0 040 99630 51 041Tebuconazole(戊唑醇)29 86250 0/125 0(15)250 0/153 0(10)y=0 49x-0 010 99901 55 042Metconazole(叶菌唑)29 87125 0/89 0(20)125 0/99 0(20)y=5 22x-0 050 99835 010 043Fenoxycarb(苯氧威)29 94255 0/186 0(10)255 0/129 0(25)y=3 06x-0 050 99921 55 044Pyriproxyfen(吡丙醚)30 06136 0/78 0(25)136 0/96 0(15)y=2 86x-0 030 99851 05 045Tetradifon(三氯杀螨砜)30 89356 0/229 0(10)356 0/159 0(10)y=3 84x+0 030 99711 55 046Pyridaben(哒螨灵)32 12147 0/117 0(25)147 0/132 0(15)y=2 74x-0 030 99811 010 047Permethrin(氯菊酯)32 37183 0/168 0(15)183 0/153 0(15)y=0 17x0 99815 010 048Etofenprox(醚菊酯)32 92163 0/135 0(10)163 0/107 0(15)y=1 83x-0 010 99781 05 049Indoxacarb(茚虫威)36 55202 9/134 0(15)202 9/106 0(10)y=10 47x+0 300 99705 010 0

图1 49种农药(含内标)混合标准液(2 mg/L)的总离子流图(TIC)Fig.1 TIC chromatogram of 49 pesticides(including ISTD) standard solution(2 mg/L)the number denoted was the same as that in Table 1

图2 5种提取液对应的回收率与平行性合格的农药占比Fig.2 Percentage of 48 pesticides with qualified REC&RSD by using different extractant

2.2 提取液的优化

对提取液的种类进行优化。在柚子基质中加入100 μg/kg的农药混标，比较了乙腈(MeCN)、正己烷、丙酮、甲醇与含1%(体积分数)醋酸的酸化乙腈对农药的提取效果。对回收率在70%～120%且RSD<20%的农药数量进行了统计，结果如图2。结果表明，正己烷极性相对较弱，不利于极性较大农药的提取；使用丙酮时净化效果较差，提取液中色素等杂质较多，影响检测结果并造成仪器污染，故本实验选用酸化乙腈作为提取液。

2.3 提取时间的优化

加入氯化钠可以增强盐析作用，加入无水硫酸镁可除去样品中水分。对柚子样品加入提取液及两种无机盐后比较了不同振荡时间(5、10、15、20 min)的提取效果。结果显示，振荡时间对提取效果无明显影响。这是因为均质过程中提取液对样品中的农药提取充分，为提高实验效率，本实验选择振荡时间为5 min。

2.4 固相萃取净化柱的优化

由于高酸水果中的果酸含量较高，传统的SPE法难以达到良好的净化效果。通过在柚子基质中进行农药加标回收实验，发现串联使用CarbonNH2与ProElutNH2萃取柱的回收率明显提升，说明该萃取柱对样品中的果酸等杂质组分有较好的净化效果，而PSA等碱性净化填料的加入会对酸性农药的检测造成较大干扰，因此选择串联使用CarbonNH2与ProElutNH2萃取柱进行萃取。

2.5 基质效应

基质效应是样品中其他组分对待测物测定值的影响，导致待测组分在进行仪器分析时的响应出现增强或抑制[21]。选用柚子的空白样品作为基质，通过测定浓度梯度为1、5、10、20、50、100 μg/kg的基质标准溶液和相对应的溶剂标准溶液，建立标准曲线，通过公式“(基质标准曲线斜率/溶剂标准曲线斜率-1)×100%”计算基质效应。结果发现大部分农药具有明显的基质效应，部分有机磷类(马拉硫磷高达109%)和拟除虫菊酯类(联苯菊酯高达116%)农药最为明显。为抵消基质效应对检测结果的影响，本研究使用基质匹配标准曲线对样品进行定量分析。

2.6 线性范围、检出限与定量下限

以柚子的空白样品作为基质进行定量加标，制备含量分别为1.0、5.0、10.0、20.0、50.0、100.0 μg/kg的基质标准样品，在优化实验条件下进行测定。结果表明，48种农药的线性关系良好，相关系数(r2)为0.995 4～0.999 8，方法的线性范围为1.0～100.0 μg/kg。以3倍信噪比(S/N=3)确定检出限，高于10倍信噪比的加标浓度确定定量下限。48种农药的检出限为0.5～5.0 μg/kg，定量下限为1.0～10.0 μg/kg(见表1)。表明该方法的萃取净化效果较好，检测的农药范围广，适用于多种水果基质中农药残留的检测。

2.7 回收率与精密度

在菠萝、柚子、橙子和山楂空白样品中进行加标回收率实验，加标水平为10、50、100 μg/kg，每个加标浓度做5个平行样品，回收率与相对标准偏差(RSD)见表2。48种农药在3个加标水平下的平均回收率分别为70.7%～118.0%、72.1%～116.3%、71.0%～115.4%，RSD不大于9.7%。方法的准确度和精密度较为理想，能够用于实际样品中农药残留的准确定量。

表2 4种水果中48种农药的回收率及相对标准偏差(n=5)Table 2 Recoveries and relative standard deviations(RSDs) of 48 pesticides spiked in 4 kinds of fruit(n=5)

(续表2)

No．Spiked(μg/kg)Recovery/%RSD/%PineapplePomeloOrangeHawthornPineapplePomeloOrangeHawthorn3010 50 10096 8 94 6 97 084 2 86 1 95 3101 4 81 1 87 279 4 93 7 88 16 7 7 0 7 53 6 3 8 7 49 1 6 7 5 28 1 2 0 3 33110 50 10084 4 95 2 92 581 9 73 0 93 5104 7 73 1 82 986 9 93 4 96 32 3 8 6 8 50 3 2 9 6 88 3 3 8 7 54 8 2 6 3 43210 50 10094 9 98 1 92 6103 3 75 5 95 993 8 72 3 86 776 1 91 8 92 70 6 7 3 5 83 3 3 9 5 62 4 5 5 5 17 1 3 5 2 03310 50 10090 3 95 7 101 387 2 95 5 98 0100 4 95 5 91 685 5 91 1 101 39 7 2 6 4 95 2 3 1 7 45 1 8 8 3 04 3 4 3 5 33410 50 10097 6 101 4 96 8106 7 87 6 95 8115 0 78 5 87 490 9 95 2 96 04 8 2 2 6 80 2 1 9 4 25 6 5 8 9 24 4 5 5 2 43510 50 100115 2 101 1 84 676 1 81 6 92 176 8 92 5 103 291 0 115 8 78 36 4 7 9 2 85 2 5 5 1 74 3 5 4 7 63 0 4 5 5 43610 50 10085 6 108 1 96 393 1 85 2 92 8114 3 77 5 87 683 3 86 8 92 23 9 6 3 4 34 0 3 7 4 32 7 7 8 7 12 3 1 4 1 13710 50 10089 7 92 0 89 690 1 92 1 93 199 0 100 9 96 370 7 86 8 94 34 2 4 5 2 80 9 6 1 2 13 0 7 9 3 57 1 2 7 4 03810 50 10083 8 95 3 92 786 6 79 1 82 6116 5 90 9 91 795 4 89 7 91 17 0 6 5 4 51 5 7 6 4 55 2 6 8 1 37 2 3 3 4 83910 50 10089 8 112 5 74 092 5 80 4 98 674 6 73 2 96 790 4 79 2 92 33 8 4 4 9 27 4 4 8 3 73 1 5 2 2 23 7 8 7 6 44010 50 10093 3 100 5 91 476 0 90 7 94 387 2 99 0 93 583 0 88 0 82 15 7 2 0 4 55 3 4 6 8 44 3 5 9 1 27 4 3 6 2 64110 50 10097 2 95 6 90 689 2 74 8 96 4103 5 79 7 88 582 9 89 3 82 93 5 0 3 5 32 0 6 0 5 03 4 4 4 4 66 1 4 1 2 74210 50 10093 3 86 9 92 489 4 85 9 96 8109 0 80 4 87 295 2 87 2 87 26 7 6 8 5 90 2 4 1 6 07 7 0 6 5 18 6 4 7 7 74310 50 10099 2 90 0 75 489 4 86 2 88 493 7 90 3 92 789 6 83 0 82 78 2 9 0 4 23 1 0 2 3 75 8 6 9 3 46 1 3 9 5 94410 50 10097 7 95 7 89 189 4 81 9 72 797 4 94 2 92 189 7 85 7 94 05 3 2 2 4 41 7 3 2 3 17 0 6 7 0 94 8 3 5 2 34510 50 10095 7 98 4 91 785 8 88 6 98 492 9 99 5 88 399 0 112 9 95 93 1 6 0 5 84 6 3 3 6 76 8 4 8 2 78 6 3 2 2 44610 50 100103 1 94 1 85 997 6 79 7 101 7111 7 86 9 87 985 5 94 2 94 74 5 5 1 3 32 5 2 4 6 97 5 8 1 1 63 9 1 7 5 04710 50 100101 4 91 8 89 494 8 94 2 111 780 7 101 1 91 891 5 99 2 86 77 0 5 8 2 94 5 1 4 6 39 1 6 6 3 55 7 6 4 5 44810 50 10089 2 88 4 90 792 4 97 0 82 087 1 92 2 93 475 4 94 4 86 73 2 8 4 7 04 9 5 6 5 19 3 5 1 2 64 6 1 3 4 74910 50 10091 5 84 8 83 794 2 83 7 91 7106 2 73 8 78 989 2 82 9 96 36 6 3 8 7 64 1 1 4 5 51 9 2 9 5 83 0 4 8 6 4

the number denoted was the same as that in Table 1

表3 12例实际样品中检出的农药及定量结果Table 3 Detection results of pesticides in 12 samples

2.8 实际样品的分析

随机抽取本地区12例市售水果样品，包括柚子、菠萝、橙、山楂各3例，采用本方法进行测定。样品检出联苯菊酯、甲氰菊酯、丙溴磷、哒螨灵4种农药，共9频次，其中丙溴磷、哒螨灵的检出频次较高，测定结果见表3，部分阳性样品的MRM图见图3。

3 结 论

本文以柚子等4种高酸水果基质作为实验对象，通过优化提取和SPE净化条件，建立了GC-MS/MS测定48种农药残留的分析方法。该方法适用性广、定量准确，检出限能够满足GB 2763-2016的要求，可应用于高酸水果基质中痕量农药残留的检测。

参考文献：

[1] Pichaiyongvongdee S,Rattanapun B,Haruenkit R.KasetsartJ.:Nat.Sci.,2014,48:989-996.

[2] Ortelli D,Edder P,Corvi C.FoodAddit.Contam.,2005,22(5):423-428.

[3] da CostaMorais E H,Rodrigues A A Z,de Queiroz M E L R.FoodControl,2014,42:9-17.

[4] Nichkova M,Fu X,Yang Z.J.Agric.FoodChem.,2009,57(13):5673-5679.

[5] Zhang W J,Jiang F B,Ou J F.Proc.Int.Acad.Ecol.Environ.Sci.,2011,1(2):125-144.

[6] Schecter A J,Li L,Ke J.J.Occup.Environ.Med.,1996,38(9):906-911.

[7] Dong C,Zeng Z,Yang M.WaterRes.,2005,39(17):4204-4210.

[8] Aysal P,Ambrus A,Lehotay S J.J.Environ.Sci.HealthB,2007,42(5):481-490.

[9] Xu G F，Nie J Y，Li H F，Yan Z，Li J.J.Instrum.Anal.(徐国锋,聂继云,李海飞,闫震,李静.分析测试学报),2016,35(8):1021-1025.

[10] Kaihara A,Yoshii K,Tsumura Y.J.HealthSci.,2000,46(5):336-342.

[11] Seebunrueng K,Santaladchaiyakit Y,Srijaranai S.Talanta,2015,132:769-774.

[12] Yang X,Zhang H,Liu Y.FoodChem.,2011,127(2):855-865.

[13] Gómez-Ramos M M,Ferrer C,Malato O.J.Chromatogr.A,2013,1287:24-37.

[14] Chen H Q，Liu J，Lan M Z.LightInd.Sci.Technol.(陈惠琴,刘佳,蓝梦哲.轻工科技),2017,33(6):4-5,29.

[15] Schenck F J,Lehotay S J,Vega V.J.Sep.Sci.,2002,25(14):883-890.

[16] Lehotay S J,Son K A,Kwon H.J.Chromatogr.A,2010,1217(16):2548-2560.

[17] Rodríguez R,Maes J,Picó Y.Anal.Chem.,2003,75(3):452-459.

[18] Silva M G D,Aquino A,Dórea H S.Talanta,2008,76(3):680-684.

[19] Fu L,Liu X,Hu J.Anal.Chim.Acta,2009,632(2):289-295.

[20] Bidari A,Ganjali M R,Norouzi P.FoodChem.,2011,126(4):1840-1844.

[21] de Sousa F A,Costa A I G,de Queiroz M E L R.FoodChem.,2012,135(1):179-185.