恩度联合顺铂治疗恶性腹腔积液的疗效及安全性评估

严 俊, 卢国丰, 王 纯, 闵 新

(上海市嘉定区中心医院1. 肿瘤科; 2. 病理科, 上海201800)

恶性腹水是肿瘤细胞浸润或分泌引起的腹腔内非正常的液体累积，是多种恶性肿瘤发展晚期的常见并发症之一。研究报道[1,2]恶性腹水可严重影响患者的生活质量，其平均生存期约为20周。目前，恶性腹水的治疗方法包括穿刺疗法、利尿剂疗法及腹腔分流术。其中腹腔分流术及腹腔注射化疗药物的方法较为常见。然而，腹腔注射化疗药物治疗腹水的有效率仅40%～60%，可能与肿瘤细胞化疗药物抵抗性或血管生成密切相关。因此，缓解肿瘤患者恶性腹水是目前临床亟待解决问题。

腹膜毛细血管通透性增加是产生恶性腹水的重要原因之一; 血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)对于刺激血管生成，增加血管通透性起到重要作用[2]。因此，抗VEGF治疗可能是治疗恶性腹水的理想方式之一。内皮抑素(endostatin)是VEGF的有效抑制剂。早期内皮抑素由O'Reilly[3]从小鼠血管内皮瘤细胞培养基中分离得到，是胶原蛋白XVIII的羧基末端蛋白水解片段。内皮抑素可显著抑制VEGF引起的上皮细胞增生及抑制血管生成和肿瘤生长[4]。然而, 胶原蛋白XVIII稳定性较差，生化活性较低，且造价昂贵，在临床应用受到了极大限制。恩度(Endostar)是大肠杆菌中表达和纯化的改良性内皮抑素[5]。与内皮抑素相比，恩度在N端增加了9个氨基酸序列，从而提高了稳定性和生物活性。并且恩度通过大肠杆菌表达生产, 可显著降低生产成本。在2005年恩度被中国食品药品监督管理局批准用于非小细胞肺癌的治疗[6]。恩度在治疗各种晚期恶性肿瘤方面取得了临床疗效[7,8]。

顺铂(Cisplatin, CDDP)是一种含铂的抗癌药物，即顺式-二氯二氨合铂(II)，棕黄色粉末，属于细胞周期非特异性药物。顺铂主要通过与肿瘤细胞DNA单链内两点或双链发生交叉联结，抑制癌细胞DNA复制过程，杀伤肿瘤细胞。目前在对腹水治疗方面，顺铂广泛用于腹腔热灌注化疗，该方法可将有效浓度顺铂持续分布到腹腔的各个部位，有利于抗癌药物与游离癌细胞充分接触; 但其疗效还依赖于肿瘤的体积大小以及肿瘤类型[9]。

目前，关于恩度联合顺铂治疗恶性腹水的有效性证据仍较为有限，本研究拟确定恩度新型适应症，为其用于治疗恶性腹水相关的晚期癌症提供理论依据和实践经验。

1 材料与方法

1.1 细胞培养

选取肝癌细胞系H-22(购自中科院上海科学研究所细胞库)体外培养。将H-22细胞复苏，加入含体积分数10%胎牛血清(购自美国Thermol-Fisher公司)的RPMI1640培养基，并将细胞置于37 ℃、体积分数5% CO2孵箱中培养待用。

1.2 恶性腹水动物模型建立

试验选用100只6～7周龄雌性BALB/c小鼠[(购于上海西普尔必凯实验动物有限公司, SCXK(沪)2013-0016)]。饲养于屏障设施[SYXK(沪)2017-0011], 自由饮水, 给予灭菌小大鼠专用饲料。将处于对数生长期的H-22细胞制成混悬液，腹腔注射给予入8只BALB/c小鼠(3×105个细胞/200 μL)体内。待小鼠体内腹水较多时以颈椎脱臼法处死动物, 抽取腹水,台酚蓝染色计数，PBS调整细胞浓度为1.5×106个细胞/mL, 每只小鼠腹腔注射200 μL备用细胞, 共接种90只动物。

1.3 分组及动物处理

将构建成功的荷瘤鼠随机分为5组, 每组18只,腹腔注射给药容量为0.2 mL，给药期间隔日测量腹围及体质量。给药用恩度(重组人血管内皮抑制素注射液)购自山东烟台先声麦得津生物工程股份有限公司，顺铂购自江苏豪森药业股份有限公司(国药准字: H20040B13)。所用恩度及顺铂用药剂量参考产品说明书。具体分组见表1。

表1 实验分组及给药

1.4 腹水体积、蛋白浓度、红细胞数量、肿瘤细胞检测

实验期间，隔日称取动物体质量，治疗结束后，每组取6只小鼠，用无菌离心管采集腹水样品，并进行蛋白浓度、红细胞数量、肿瘤细胞的检测，其余动物观察各组荷瘤寿命，以对照组全部死亡为实验结束的节点。蛋白浓度检测使用全自动生化检测仪进行检测。

1.5 腹水瘤细胞中VEGF、Bax，Bcl-2和HIF-1a水平检测

转膜后，聚偏二氟乙烯(PVDF)膜在5%BSA中封闭1h，加入适量一抗孵育过夜，之后用PBST洗膜3次，与适量二抗孵育1h，充分洗膜后加入显影液，使用曝光机进行拍摄。

Western blotting采用Quantity One分析软件，用矩形选择工具框选目的条带, 计算灰度值, 用条带框的值减去等大的背景框灰度，得到条带的灰度值。分别用各实验组的数值比照未经任何处理的空白小鼠相应条带灰度值，得到标准化的条带浓度。

1.6 腹水瘤细胞中VEGF mRNA水平检测

1.6.1 引物合成 采用Premier 5.0设计引物，引物由上海生工生物工程公司合成。引物名称、扩增靶基因号及对应引物序列见表2。

1.6.2 RNA提取 采用RNA提取试剂盒(购自北京TIANGEN生化，dp419)进行提取。

1.6.3 反应体系 采用20 μL反应体系: 2×Real time PCR Master Mix 10 μL, 模板 1 μL，引物 MIX 2 μL，DEPC 水 7 μL。

1.6.4 PCR 过程 95℃ 5 min→ 95 ℃ 15 s → 60℃30 s → 72℃ 30 s → 45 ℃→ 95℃, 40 个循环。

表2 实验所用引物

1.6.5 定量方法 以β-actin作为内参，各样本中VEGFmRNA的ct值与同一样本中的β-actinRNA ct值相减。采用相对定量法，以2-△△Ct公式计算各样本中的VEGFmRNA表达量。

(1) 坡体地质条件。项目区属构造剥蚀高山峡谷的上缓下陡形台阶状地貌，自然边坡高约400 m，其上部较缓边坡坡度约40°，下部陡崖坡度约70°～80°，崖顶与坡脚高差约190 m，坡向50°，线路以大桥的形式从坡脚通过，桥面高出河道约6 m。坡体主要由志留系茂县群(Smx4)绢云母千枚岩和夹少量条带—薄层状变质细砂岩构成。由于坡体位于桃坪倒转背斜核部，造成坡体褶皱、挤压破碎带发育。边坡优势产状345°∠77°，属陡倾斜交结构边坡。项目区地震动峰值加速度0.20 g，地震基本烈度Ⅷ度。下半球赤平投影见图9，工程地质断面图见图10。

1.7 荷瘤小鼠腹水中肿瘤细胞凋亡检测

收集各组小鼠腹水约5 mL，加入红细胞裂解液，孵育10 min后2 000 r/min离心5 min，收集肿瘤细胞，并用PBS洗涤2次。加入500 μL Binding Buffer重悬细胞，加入Annexin V-FITC及Propidium Iodide混匀，室温避光孵育10 min，采用流式细胞仪检测。

1.8 小鼠生存期观察

记录每只小鼠生存时间，采用Kaplan-Meier法绘制生存曲线，并按下列公式计算小鼠生命延长率: 生命延长率=(治疗组平均生存时间/对照组平均生存时间-1)×100%

1.9 统计分析

采用 SPSS 21.0 软件进行数据统计及分析。连续变量采用平均值±标准差表示。组间比较采用One-way ANOVA，采用Kaplan-Meier法绘制生存曲线。P＜0.05为差异有统计学意义。采用药物相互作用指数(coefficient of drug interaction，CDI)来反映两药联合抑制腹水的作用。根据以下公式计算各组小鼠腹水抑制率及CDI，两药联用CDI值＜1，说明恩度及顺铂具有协同作用。腹水抑制率=(1-给药组平均腹水量/生理盐水组平均腹水量)×100%;CDI=恩度顺铂联合给药腹水抑制率/(单独恩度组腹水抑制率×单独顺铂组腹水抑制率)。

2 结果

2.1 各组小鼠体质量及腹围分析

给药期间各组小鼠体质量变化曲线见图1。重复测量ANOVA分析显示, 各实验组给药期间体质量增长速度均显著低于生理盐水组(P=0.012)，其中恩度联合顺铂组1小鼠体质量增长速度显著低于单纯恩度组(P=0.006)、单纯顺铂组(P=0.019)和恩度联合顺铂组2(P=0.004)。给药期间各组小鼠腹围变化曲线见图2。重复测量ANOVA分析显示，各实验组给药期间腹围增长速度均显著低于生理盐水组(P=0.001), 其中恩度联合顺铂组1小鼠腹围增长速度显著低于单纯恩度组(P＜0.001)、单纯顺铂组(P=0.034)小鼠和恩度联合顺铂组2(P＜0.001)。

2.2 小鼠平均腹水量及红细胞计数

各组小鼠腹水量组间差异有统计学意义(图3A，P＜0.01), 两两分析显示, 生理盐水组小鼠腹水量显著高于单纯恩度组(P=0.02)、单纯顺铂组(P＜0.01)、恩度顺铂联合组1(P＜0.01)和恩度顺铂联合组2(P=0.01);恩度联合顺铂组1小鼠腹水量显著低于单纯恩度组(P＜0.01)、单纯顺铂组(P＜0.01)和恩度联合顺铂组2(P=0.02)。各组小鼠腹水中红细胞数量组间差异有统计学意义(图3B,P＜0.01)，两两分析显示，生理盐水组小鼠腹水中红细胞量显著高于各实验组(均P＜0.01); 恩度联合顺铂组1小鼠腹水中红细胞含量显著低于单纯恩度组(P＜0.01)和单纯顺铂组(P＜0.01)。

图1 给药期间各组小鼠体质量变化曲线

图2 给药期间各组小鼠腹围变化曲线

2.3 各组小鼠腹水中肿瘤细胞数量及凋亡情况

图3 各组小鼠腹水量及红细胞计数

各组小鼠腹水中肿瘤细胞数量有统计学差异(图4A，P＜0.01), 两两分析显示, 生理盐水组鼠腹水中肿瘤细胞数量显著高于单纯恩度组(P=0.01)、单纯顺铂组(P＜0.01)、恩度顺铂联合组1(P＜0.01)和恩度顺铂联合组(P=0.01)，单纯顺铂组腹水中肿瘤细胞数量与恩度顺铂联合组差异无统计学意义。

各组小鼠肿瘤细胞凋亡率组间差异有统计学意义(图4B,P＜0.01)，两两分析显示，生理盐水组小鼠腹水中肿瘤细胞凋亡率显著低于顺铂、恩度顺铂联合组1和恩度顺铂联合组2(均P＜0.01)，但与单纯恩度组相比差异无统计学意义。

2.4 各组小鼠肿瘤细胞中凋亡相关蛋白表达情况

各实验组腹水肿瘤细胞Bcl-2及HIF1α表达量均低于生理盐水组，Bax表达量均高于生理盐水组。单纯恩度组Bcl-2及HIF1α表达量变化低于单独顺铂组和联用顺铂各组(图5)。

2.5 各组小鼠肿瘤细胞中VEGF蛋白及VEGF mRNA水平

细胞中VEGF水平，PCR方法检测各组小鼠腹水肿瘤细胞中VEGFmRNA水平，结果显示，单纯恩度组、恩度联合顺铂组1和恩度联合顺铂组2小鼠腹水肿瘤细胞中VEGF蛋白表达量和VEGFmRNA水平均显著低于生理盐水组及单纯顺铂组，单纯顺铂组VEGF蛋白表达量和VEGFmRNA水平显著低于生理盐水组。

2.6 小鼠平均生存时间

对各组小鼠生存时间进行分析，Logrank分析显示恩度联合顺铂对于小鼠的生存时间有显著延长作用(P＜0.001，图7)。

2.7 顺铂及恩度联合作用

根据以下公式计算各组小鼠腹水抑制率及CDI，结果见表3。两药联用CDI值＜1，说明恩度及顺铂具有协同作用。

图4 各组小鼠腹水中肿瘤细胞数及肿瘤细胞凋亡情况

图5 各组小鼠腹水肿瘤细胞中Bcl-2、Bax及HIF1α水平

图6 各组小鼠腹水肿瘤细胞中VEGF蛋白及VEGF mRNA水平比较

图7 各组小鼠生曲线

3 讨论

研究表明，恶性患者的胸腔积液和腹水中可检测到高浓度VEGF[10,11]，肿瘤细胞所释放的VEGF可造成血管大量生成、血管通透性增加[12,13]。同时，由于腹水中含有大量肿瘤细胞，腹水渗漏也有可能造成肿瘤的侵袭和转移。因此，减少恶性腹水生成并减少腹水中肿瘤细胞数量是治疗恶性腹水重点。据报道[6-9]恩度对于恶性腹水有明显的抑制作用，而对于腹水中肿瘤细胞杀伤作用较为温和; 顺铂可与肿瘤细胞DNA结合，显著杀伤肿瘤细胞。为此，本研究采用顺铂与恩度联合用药，旨在研究恩度联合顺铂是否可以影响恶性腹水的生成、减少腹水中肿瘤细胞并延长生存期。

表3 各组腹水抑制率及CDI值

本试验采用小鼠为模型。结果显示，恩度和顺铂单独使用均可减少小鼠产生的腹水体积，同时降低腹水中肿瘤细胞和RBC的数量，延长注射恩度小鼠的生存时间，而两者联用效果更好。同时，先前研究[14]也表明恩度仅能抑制腹水的形成，不能抑制肿瘤的生长。本研究中单独使用恩度，不能造成肿瘤凋亡，然而单独使用顺铂或者联合使用顺铂和恩度，可以显著增加腹水中肿瘤细胞的凋亡率。此外，单独使用恩度或顺铂组小鼠腹水量及腹水中红细胞比例明显低于对照组小鼠。这说明恩度和顺铂可以有效减少红细胞渗漏入腹水; 同时，联用恩度及顺铂组小鼠腹水量、腹水中红细胞比例及生存期均显著优于单独用药组小鼠，说明恩度和顺铂联用可有效抑制腹水产生，减少腹水中红细胞渗透率，延长动物生存期。

已有研究表明，内皮抑制素的作用与VEGF有关，VEGF是血管生成的重要调节剂[15]，而恩度正是通过与内皮抑制素相似的机制产生抗血管生成的效应。与内皮抑制素不同，恩度增加了9种氨基酸，从而可以有效提高蛋白质的半衰期，并与锌结合[16]。当被蛋白水解作用激活时，内皮抑制素可通过抑制血管内皮细胞的增殖、迁移和分化及促进细胞凋亡来发挥抗血管生成活性。也有研究证明，内皮抑制素可通过与肿瘤细胞表面受体(如整合素受体)结合来起到直接的抗肿瘤作用。体外数据显示，内皮抑素抑制癌细胞生长和迁移，阻止G1期癌细胞，诱导癌细胞凋亡。此外，它是一种广谱和低毒多靶点血管生成抑制剂，可抑制多达65种类型的肿瘤[17]，在治疗各种晚期恶性肿瘤方面取得了临床疗效[6,7]。临床证据显示，恩度结合化疗药物，可在抑制肿瘤发展中发挥协同作用。此外，在广泛非小细胞肺癌的患者中联合使用恩度和铂类化疗药物，不会增加铂类化疗药物的毒性。本研究中恩度及顺铂联合给药优于单独给药，分析其原因可能有两点: 首先是顺铂可以直接作用于肿瘤细胞，从而诱发肿瘤细胞的坏死，而恩度可以降低小鼠腹膜渗透性，减少血管生成; 其次，恩度可以促进肿瘤血管功能正常化，改善局部微环境，更加有效地促进顺铂被输送到肿瘤组织，从而更有效杀灭肿瘤细胞。

联用恩度及顺铂组小鼠腹水量、腹水中红细胞比例及生存期均显著优于单独用药组小鼠，说明恩度和顺铂联用具有协同作用，可有效抑制腹水产生，减少腹水中红细胞渗透率，延长小鼠生存期。其中每日给予恩度效果优于隔日给予恩度。

[1]Le Corvec M, Jezequel C, Monbet V, et al. Mid-infrared spectroscopy of serum, a promising non-invasive method to assess prognosis in patients with ascites and cirrhosis[J].PLoS One, 2017, 12(10):e0185997.

[2]Bekes I, Friedl TW, Kohler T, et al. Does VEGF facilitate local tumor growth and spread into the abdominal cavity by suppressing endothelial cell adhesion, thus increasing vascular peritoneal permeability followed by ascites production in ovarian cancer?[J]. Mol Cancer, 2016, 15:13.

[3]O'Reilly MS, Boehm T, Shing Y, et al. Endostatin: an endogenous inhibitor of angiogenesis and tumor growth[J].Cell, 1997, 88(2):277-285.

[4]Zhang YC, Li XM, Yu Z, et al. Efficacy of pEgr-1-endostatin combined with ionizing radiation on hypoxic conditions in nude mice bearing SKOV3 ovarian carcinoma[J]. Oncol Lett,2017, 13(3):1101-1108.

[5]Ren Z, Wang Y, Jiang W, et al. Anti-tumor effect of a novel soluble recombinant human endostatin: administered as a single agent or in combination with chemotherapy agents in mouse tumor models[J]. PLoS One, 2014, 9(9):e107823.

[6]Tong Y, Zhong K, Tian H, et al. Characterization of a monoPEG20000-Endostar[J]. Int J Biol Macromol, 2010,46(3):331-336.

[7]Zhang Q, Cao J, Xue K, et al. Recombinant human endostatin in combination with CHOP regimen for peripheral T cell lymphoma[J]. Onco Targets Ther, 2017, 10:145-151.

[8]Biaoxue R, Xiguang C, Hua L, et al. Thoracic perfusion of recombinant human endostatin (Endostar) combined with chemotherapeutic agents versus chemotherapeutic agents alone for treating malignant pleural effusions: a systematic evaluation and meta-analysis[J]. BMC Cancer, 2016, 16(1):888.

[9]Hochster HS, Piccart M. Intraperitoneal chemotherapy:belly bath or pain in the side[J]. Eur J Cancer Clin Oncol,1987, 23(3):259-261.

[10]Hirayama N, Tabata C, Tabata R, et al. Pleural effusion VEGF levels as a prognostic factor of malignant pleural mesothelioma[J]. Respir Med, 2011, 105(1):137-142.

[11]Abdel-Razik A, Mousa N, Elalfy H, et al. A novel combination of C-reactive protein and vascular endothelial growth factor in differential diagnosis of ascites[J]. J Gastrointest Cancer,2017, 48(1):50-57.

[12]Yin T, Wang G, He S, et al. Malignant pleural effusion and ascites induce epithelial-mesenchymal transition and cancer stem-like cell properties via the vascular endothelial growth factor (VEGF)/phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K)/Akt/mechanistic target of rapamycin (mTOR) Pathway[J]. J Biol Chem, 2016, 291(52):26750-26761.

[13]Yang L, Zhang Y, Cheng L, et al. Mesenchymal stem cells engineered to secrete pigment epithelium-derived factor inhibit tumor metastasis and the formation of malignant ascites in a murine colorectal peritoneal carcinomatosis model[J]. Hum Gene Ther, 2016, 27(3):267-77.

[14]Wei H, Qin S, Yin X, et al. Endostar inhibits ascites formation and prolongs survival in mouse models of malignant ascites[J]. Oncol Lett, 2015, 9(6):2694-2700.

[15]Mostmans Y, Cutolo M, Giddelo C, et al. The role of endothelial cells in the vasculopathy of systemic sclerosis: A systematic review[J]. Autoimmun Rev, 2017, 16(8):774-786.

[16]Han Q, Fu Y, Zhou H, et al. Contributions of Zn(II)-binding to the structural stability of endostatin[J]. FEBS Lett, 2007,581(16):3027-3032.

[17]Mohajeri A, Sanaei S, Kiafar F, et al. The challenges of recombinant endostatin in clinical application: focus on the different expression systems and molecular bioengineering[J]. Adv Pharm Bull, 2017, 7(1):21-34.