水产品中的形态汞测定方法的比较与分析

乔晴，彭新然，刘军红，何兵兵，李辰

（河南出入境检验检疫局，河南郑州450003）

汞是具有挥发性、持久富集性、毒性较大的有毒重金属元素之一。汞的不同形态表现出的毒性不同，都会损害人体的神经系统、免疫系统，严重威胁人类健康，其中有机汞中的甲基汞毒性最大。汞及其化合物广泛存在于环境和食物链中，尤其是鱼、贝类等人类经常摄入的水产品，通过食物链生物放大作用，体内富集的汞含量远超出环境中汞含量，并且主要以甲基汞形态存在[1-4]。因此，对水产及制品中的甲基汞检测尤为重要。

近年来，形态分析方法的建立和改进，已经成为分析研究的一大趋势。针对生物样品分析的前处理方法有多种，而微波消解法、超声提取法具有提取效率高、操作简便、适应性广等优势[5-6]。汞的形态分析主要有采用气相色谱－质谱联用法，原子荧光、紫外检测器、电感耦合等离子体质谱的检测手段与高效液相色谱的分离手段联用等各种技术[7-10]。这些分析方法极大的方便了测定水产及制品中甲基汞和无机汞含量。

本文采用超声辅助和微波辅助酸提取两种方法对样品前处理，优化处理的条件，比较实验条件对提取效果的影响。然后采用液相色谱-电感耦合等离子体质谱联用法（high performance liquid chromatographyinductive coupled plasma emission spectrometer-mass spectrometer，HPLC-ICP-MS）和液相色谱-原子荧光联用法（liquid chromatography-atomic fluorescence spectroscopy，LC-AFS），选择最佳仪器条件测定水产及制品中的甲基汞和无机汞含量。本文通过研究有害元素汞的形态分析技术实现对水产及其制品中的甲基汞、无机汞含量的准确检测，将为保障我国食品安全，预防汞污染对人体的危害，应对国外技术壁垒，提高本国产品的出口竞争力提供参考依据，具有很强的应用前景和潜在的社会效益。

1 材料与方法

1.1 仪器

MARS 5微波消解仪：CEM公司；LC-AFS 6500液相色谱原子荧光联用仪：北京科创海光公司；ICP-MS 7900电感耦合等离子体质谱仪、HPLC 1200高效液相色谱、ICP-MS PFA雾化器、Zorbax Eclipse Plus C-18（150 mm×4.6 mm，5 μm）：美国安捷伦公司；Agela Venusil MP C-18（150 mm×4.6 mm，5 μm）：博纳艾杰尔科技有限公司；XP205型电子天平：瑞士梅特勒-托利多公司；Z300K高速冷冻离心机：德国哈默公司；KANG SHIJIE PL-J60超声波清洗机：东莞康士洁公司；0.45 μm滤膜：天津市津腾实验设备有限公司；Millipore超纯水系统：法国密理博公司。

1.2 试剂

试验用水为符合GB/T 6682-2008《分析实验室用水规格和试验方法》规定的一级水；氢氧化钾（优级纯）、硼氢化钾（分析纯）：天津市科密欧化学试剂有限公司；过硫酸钾（分析纯）、L-半胱氨酸盐酸盐（生化试剂）：天津市致远化学试剂有限公司；氨水（分析纯）：烟台市双双化工有限公司；乙酸铵（优级纯）、甲醇（色谱纯）：赛默飞世尔科技有限公司；氢氧化钠（优级纯）：国药化学试剂有限公司；盐酸（优级纯）：北京化工厂；甲基汞标准溶液（GBW 08675，63.6±2.4 μg/g）、无机汞标准溶液（GBW 08617，1000 μg/mL）：国家标准物质研究中心。

1.3 溶液的配制

5 mol/L盐酸：量取41.66 mL盐酸，用水稀释定容至100 mL。

5 mol/L盐酸+0.10%L-半胱氨酸：称取0.1 g L-半胱氨酸，用水溶解，缓慢加入41.66 mL盐酸，用水稀释定容至100 mL。

氢氧化钠溶液（6 mol/L）：称取24 g氢氧化钠溶于水并稀释至100 mL。

LC-AFS流动相（5.0%甲醇+0.06 mol/L乙酸铵+0.10%L-半胱氨酸）：称取0.5 g L-半胱氨酸，2.2 g乙酸铵，至于从500 mL容量瓶中，用水溶解，加入25 mL甲醇，定容500 mL。用20%氨水溶液调节pH值至7.5，经0.45 μm滤膜过滤，超声脱气30 min。

HPLC-ICP-MS流动相A（10 mmol/L乙酸铵，0.10%L-半胱氨酸，pH=7.5）：称取0.771 g乙酸铵和1 g L-半胱氨酸，用水溶解，加水稀释定容至1000 mL。用20%氨水溶液调节pH值至7.5，经0.45 μm滤膜过滤，超声脱气30 min；流动相B：甲醇。

甲基汞标准储备液（2 μg/mL）：准确称取0.7862 g甲基汞标准溶液，用2%甲醇稀释定容至25 mL。

无机汞标准储备液（2 μg/mL）：准确称取10 mL无机汞标准溶液，用5%盐酸稀释定容至100 mL，再分取2 mL用2%甲醇稀释定容至100 mL。

混合标准使用液（50 ng/mL）：准确移取甲基汞标准储备液和无机汞标准储备液各0.625 mL，用2%甲醇稀释定容至25 mL，使用时现配。

1.4 方法

1.4.1 样品处理

取三文鱼可食部分，用捣碎机打成匀浆，混匀，均分成两份作为试样，分别装入洁净的容器内，密封并标明标记。试样应于-18℃以下保存。

1.4.2 微波消解前处理法

称取样品1 g（精确到0.001 g），加入10 mL5 mol/L盐酸，按照预先设定的条件消解，微波消解仪参数见表1。

表1 微波消解仪参数Table 1 Parameters of microwave digestion instrument

取1 mL样液至25 mL刻度管中，缓慢逐滴加入氢氧化钠溶液（6 mol/L）溶液，调节pH值至2～7，用水定容至10 mL，用0.45 μm滤膜过滤，待测。同时作空白试验。

1.4.3 超声辅助提取前处理法

称取样品1 g（精确到0.001 g），置于25 mL离心管中，加入10 mL提取溶液（5 mol/L盐酸+0.10%L-半胱氨酸），放置过夜。在20℃下超声萃取1.5 h，期间振摇数次。于4℃下以4500 r/min离心30 min。移取4 mL上清液至25 mL刻度管中，缓慢逐滴加入氢氧化钠溶液（6 mol/L）溶液，调节pH值至2～7，用水定容至10 mL，用0.45 μm滤膜过滤，待测。同时作空白试验。

1.4.4 LC-AFS法仪器条件

色谱柱：AgelaVenusilMPC-18分析柱，长150mm，内径4.6 mm，粒度5 μm；流动相：5.0%甲醇+0.06 mol/L乙酸铵 +0.1%L-半胱氨酸；进样体积：100 μL；流速：1.4 mL/min。

载流：10%HCl；氧化剂：过硫酸钾溶液（2 g/L）；还原剂：硼氢化钾溶液（2 g/L）；紫外消解仪：开；负高压：300 V；原子化器高度：10 mm；灯电流：30 mA；载气流量：500 mL/min；屏蔽气流量：900 mL/min；泵转速：80 r/min。

1.4.5 HPLC-ICP-MS法仪器条件

色谱柱：Agilent ZORBAX Eclipse Plus C-18柱（4.6 mm×150 mm，5 μm）；流动相：流动相 A ∶流动相B=98 ∶2；流速：1.0 mL/min；进样量：50 μL。

射频功率：1550 W；射频匹配：1.80 V；载气流量：0.44 L/min；采样深度：8.0 mm；雾化室温度：-5℃；积分时间：1 s；质量数：202；蠕动泵转速：0.30 r/s。

1.4.6 样品测定

分别采用1.4.4和1.4.5所述仪器条件依次对混合标准溶液系列、空白溶液和试样溶液进行测定，以其标准溶液峰的保留时间定性，用标准工作曲线对试样进行定量。按步骤，对同一试样进行平行试验测定。

2 结果与讨论

2.1 两种样品前处理方法的比较

样品的前处理方法是汞的形态分析中最重要的步骤之一，关键是如何防止样品污染，克服汞的吸附和挥发，避免汞及其化合物在提取过程中可能产生的损失[11-12]。

2.1.1 提取剂的选择

水产及制品的样品基体复杂，蛋白含量高，试验比较了碱消解和酸消解的提取效果，发现酸消解的提取效果和稳定性更好，而碱消解提取所需时间较长，在甲基汞含量较低时会存在复杂的基体效应。因此，试验选用5 mol/L盐酸作为水产及其制品样品汞形态分析的提取剂。

2.1.2 微波消解前处理法条件优化

微波消解萃取试剂污染小，重现性高，在微波消解过程中不会破坏碳-金属元素键，适用于元素形态分析的前处理[13-15]。微波消解的温度和消解时间对样品中汞及化合物的提取效率均有影响。若微波消解温度太低反应速度慢，消解时间太长。若微波消解温度压力过高，反应剧烈，极易造成汞及化合物的损失。试验选取标准物质SRM 2976贻贝（甲基汞范围28.09±0.31 μg/kg）进行测定，加入 25 μg/kg的无机汞、甲基汞混合标准溶液，分别选择5个保持时间和5个消解温度，通过HPLC-ICP-MS测定样品的加标回收率进行微波消解条件优化，结果见表2。

表2 微波辅助提取的加标回收率Table 2 Recoveries of microwave-assisted extraction

结果表明，微波消解优化最佳条件为消解温度为85℃，提取剂为5 mol/L盐酸，保持时间为15 min。另外，要选择高压密闭的微波消解仪进行消解提取，防止汞及化合物的损失。

2.1.3 最佳超声提取条件的确定

目前汞的形态分析主要是通过盐酸+L-半胱氨酸作为提取溶液[16]，L-半胱氨酸中的S与Hg结合形成金属-半胱氨酸络合物，并在一定的酸度下，把样品中无机汞和甲基汞提取出来。试验选取标准物质SRM 2976贻贝进行测定，加入25 μg/kg的无机汞、甲基汞混合标准溶液，HPLC-ICP-MS测定不同盐酸、L-半胱氨酸用量以及不同超声时间的加标回收率，结果见表3。

表3 超声辅助提取的加标回收率Table 3 Recoveries of ultrasonic-assisted extraction

结果表明，盐酸浓度越大加标回收率越高，但盐酸浓度逐渐增加，中和盐酸的碱溶液增多，会对ICP-MS检测器有影响，综合考虑，选取5 mol/L盐酸+0.10%L-半胱氨酸，超声提取1.5h作为最佳超声提取条件。

2.2 两种测定分析方法的比较

2.2.1 LC-AFS法操作要点

依据GB 5009.17-2014《食品安全国家标食品中总汞及有机汞的测定》中第二篇食品中甲基汞的测定，选择流动相为5.0%甲醇+0.06 mol/L乙酸铵+0.10%L-半胱氨酸，测定5 ng/mL汞混合标准溶液，无机汞、甲基汞的保留时间分别为1.810 min，2.592 min，结果见图1。

图1 LC-AFS色谱分离图Fig.1 The separation chromatographic of LC-AFS

2.2.2 HPLC-ICP-MS法操作要点

试验选用乙酸铵为缓冲盐来调节峰形，L-半胱氨酸作为络合剂与各种汞形态反应形成非极性化合物进行分离，改变流动相中甲醇的含量使出峰时间最佳。通过比较，选择流动相A（10 mmol/L乙酸铵，0.10%L-半胱氨酸，pH=7.5）：流动相 B（甲醇）=（体积比为 98∶2），测定5 ng/mL汞混合标准溶液，无机汞、甲基汞的保留时间分别为1.751 min，2.501 min，见图2。

图2 HPLC-ICP-MS色谱分离图Fig.2 The separation chromatographic of HPLC-ICP-MS

2.3 标准曲线和检出限

混合标准工作液：分别移取混合标准使用液0、0.2、0.4、0.8、1.2、2.0 mL 于一组 10 mL 容量瓶中，用流动相定容至刻度，得到甲基汞和无机汞的浓度分别0.0、1.0、2.0、4.0、6.0、10.0 ng/mL 的混合标准工作液。

待仪器状态稳定后，调节LC-AFS和HPLC-ICPMS仪器条件达到最优，以色谱峰面积为纵坐标，标准溶液中无机汞和甲基汞的浓度为横坐标，绘制标准曲线，得到线性回归方程和相关系数，检出限为3倍基线噪声（3S/N），结果见表4。

表4 线性范围和方法检出限Table 4 Calibration curve and limit of detection

由表4可以看出LC-AFS和HPLC-ICP-MS两种方法的无机汞、甲基汞在1.0 ng/mL～10 ng/mL范围内呈现良好的线性关系，检出限均可满足检测要求。

2.4 回收率和精密度

按照1.4.4和1.4.5中所列仪器条件，选取三文鱼肉样品，进行不同浓度水平的加标回收率和精密度实验。结果见表5。

表5 加标回收率和精密度结果Table 5 Recoveries and precisions

续表5 加标回收率和精密度结果Continue table 5 Recoveries and precisions

结果表明，4种试验方法测定甲基汞、无机汞加标回收率结果可达到GB/T 27404-2008《实验室质量控制规范食品理化检测》要求，其中超声提取-液相色谱-电感耦合等离子体质谱法的重现性最好。

2.5 标准物质的验证

采用1.4中4种试验方法，用标准物质SRM 2976贻贝（甲基汞范围28.09±0.31 μg/kg）验证方法准确性，结果见表6。

表6 标准物质测定结果Table 6 Results of standard reference materials

结果表明，4种试验方法甲基汞结果均在范围以内，超声提取-液相色谱-电感耦合等离子体质谱法的重现性最好。

3 结论

试验采用超声辅助和微波辅助酸提取两种方法对样品进行前处理，然后用LC-AFS和HPLC-ICP-MS测定水产及制品中的无机汞和甲基汞含量。经过比较，两种前处理方法均有较高的提取率，微波辅助提取节省时间，试剂、污染小；超声辅助萃取的操作简单，应用性更强。两种测定方法的检出限、回收率和精密度均能满足水产及制品的检测要求，LC-AFS结构简单，易操作，分析成本低，但在LC-ICP-MS价格昂贵，操作要求高，但灵敏度高，选择性强，对分析基质复杂样品中的甲基汞和无机汞分离效果更稳定可靠，准确度高。因此，超声辅助萃取HPLC-ICP-MS法更适合测定水产及制品中的无机汞和甲基汞含量。

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