HEK293T细胞中验证靶向猪ApoE基因TALEN活性

徐华荣，雒志新，李 托，王 昕

(西北农林科技大学 动物科技学院，陕西 杨凌 712100)

ApoE (Apolipoprotein E)蛋白是人血浆中五类载脂蛋白之一，分为三个亚型[1-2]。有报道称，ApoE基因的多态性与阿尔兹海默病(Alzheimer's disease，AD)的发生有关[3-6]。此外，ApoE蛋白被认为参与了血管相关疾病病变过程[7-8]，但其具体的生物学功能目前并不清楚。类转录激活因子效应物核酸酶(Transcription activator-like effector nuclease，TALEN)是一种组装简单、定点敲除和细胞毒性低的基因敲除技术[9-10]，目前已经成功应用于各类动植物体的基因编辑中[11-13]。本试验构建靶向敲除猪ApoE基因的TALEN，并在HEK293T细胞中利用双荧光报告系统验证其特异切割活性，为进一步构建猪疾病模型提供技术依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

T4 DNA连接酶及内切酶BsmBI购买于NEB，Taq DNA聚合酶购自全式金生物公司，质粒小提试剂盒购自Omega公司，DNA凝胶回收试剂盒购自威格拉斯。载体pST-TALEN-Backbones、pmRFP-EGFP-MCS、TALEN模块质粒文库，DH5α菌株，HEK293T细胞系均由本课题组保存。引物为上海博尚生物技术公司合成(表1)；载体序列测序由南京金思瑞生物科技有限公司完成。

1.2 方 法

首先利用在线TAL Effector Nucleotide Targeter2.0工具[14]，在ApoE基因第四外显子靶点位置左右各选择一段TALE结合位点，然后采用本课题组先前报道的TALE组装方法，利用TALE质粒文库组装TALEN[15]，并进一步利用双荧光报告系统在HEK293T细胞中验证其工作活性[16]。

1.2.1 TALEN表达载体的构建 利用TAL Effector Nucleotide Targeter 2.0网站的TALN Targeter工具，在ApoE基因的第四外显子靶位点的序列中，选择推荐的TALE蛋白特异结合的序列。根据结合靶点位置的TALE蛋白氨基酸，选择相应的TALE四联模块，并采用PCR方法扩增各个模块(表1引物)。菌落PCR检测阳性克隆(表1引物)，经酶切鉴定后，将阳性克隆进行测序确认，获得针对ApoE基因的TALEN真核表达载体PST-ApoE-Left和PST-ApoE-Right，-20 ℃保存。

1.2.2 报告载体构建 报告引物经95 ℃变性，65 ℃退火连接，获得左右各带NotI和BamHI酶切位点的粘性末端片段，psDRED骨架载体经NotI和BamHI酶切后回收骨架片段，将两者按照一定比例混合，T4连接酶16 ℃连接过夜。以CMV和报告载体的下游引物为上、下游引物，进行菌落PCR鉴定，阳性克隆送测序公司测序鉴定。

1.2.3 双荧光报告系统检测TALEN的活性 将HEK293T细胞接种在12孔板上培养，试验组将TALEN表达载体和对应的报告载体混合共转染，并设置转染TALEN骨架载体和双荧光报告载体的对照组。转染10 h后更换细胞培养液。共转24 h及48 h后，在倒置荧光显微镜下观察细胞红绿荧光的发光情况。

2 结 果

2.1 TALEN结合位点四联模块选择及扩增

通过https://tale-nt.cac.cornell.edu/node/add/talen在ApoE基因第四外显子靶点左右各选择一段序列作为TALE结合位点(表2)。左侧识别结合位点为GGG CGC CGA CAT，右侧为AGA GCA CCA AGC。在TALE质粒文库中选择出对应的模块。

采用表1的引物将6个相应的四联模块PCR扩增，获得引入BsmBI酶切位点的片段，取1 μL PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测(图1)，获得465 bp左右的DNA条带，TALE模块扩增完成。

2.2 ApoE-TALEN表达载体及双荧光报告载体构建

将ApoE-TALEN表达载体用NotI和EcoRI双酶切消化获得5 600 bp和 2 300 bp的目的片段(图2，2、3号泳道)。阳性克隆测序验证与模拟克隆序列相同，成功获得ApoE-TALEN真核生物表达载体。报告载体经测序检测，目的片段序列正确。

表1 组装TALEN四联模块、报告引物及测序引物序列表Table 1 Oligonucleotide sequences of primers for vector construction, detection and sequencing

表2 TALE四联模块的选择Table 2 Tetramers of TALE

图1 PCR扩增四联模块 M. Trans2K Plus DNA Maker；1-3.模块L1，L2，L3； 4-6模块R1，R2，R3Fig.1 Amplified tetramers by PCR M. Trans2K Plus DNA Maker; 1-3. tetramers:L1，L2，L3；4-6. tetramers:R1，R2，R3

图2 pST1374-TALEN-ApoE表达载体酶切鉴定 M. Trans 15K Marker；1. pST1374空白对照；2，3.阳性质粒Fig.2 Digestion identification of pST1374-TALEN- ApoE expression vector M. Trans15K Marker; 1. pST1374 blank control; 2，3.positive plasmid

2.3 TALEN的活性检测

ApoE-TALEN表达载体及双荧光报告载体共转染HEK293T细胞，培养24 h及48 h后倒置荧光显微镜下观察。白光观察细胞状态，红光检测转染效率，绿光指示TALEN工作。在转染HEK293T细胞24 h后，有较弱的荧光。48 h后，在试验组观察到有绿色荧光表达，对照组没有，说明TALEN能够在真核细胞中工作(图3)。

图3 ApoE-TALEN双荧光报告系统活性检测结果Fig.3 The fluorescence results in HEK293T cells treated by TALEN

3 讨 论

基因敲除是一种有效的研究基因功能的方法，可达到从根本上沉默靶基因的目的[17]。TALEN作为简单实用基因编辑技术，其基于Golden Gate优化的组装方法大大推动了基因定点修饰的进程。各种基于TALEN技术的动植物突变体以及细胞突变系的报道不断涌现，为生命科学研究提供了不可或缺的研究材料[18]。ApoE基因与各种衰老现象及心血管疾病发生相关，被认为是潜在治疗老年痴呆的靶基因[19]，但目前其具体的生物学功能并不清楚。

本研究利用本课题组快速高效组装TALEN的方法一周内完成了靶向ApoE基因的TALEN组装，与组装ZFNs相比极大缩短了试验周期[15]。并进一步在HEK293T细胞中通过双荧光报告系统中绿色荧光蛋白的表达情况指示TALEN的工作活性[16]。将TALEN的检测结果与之前构建的两对ZFNs的结果做了比较，从绿色光斑的比例上来说，ZFN1的效率最高，其次是TALEN，而ZFN2的效率则最低[20]。造成这种结果的原因很可能是因为三者选择的ApoE基因靶向位点不同的位置效应，影响到了FokI的切割活性。当然不同的质粒转染效率以及细胞状态也会对结果产生一定的影响。多位点的靶向敲除为彻底的沉默基因功能提供了保障。由于猪在生理机能方面与人的高度相似性，因此利用猪作为疾病模型来研究ApoE的致病机理，具有重要的理论意义。

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