饲用缓释尿素对模拟瘤胃体外发酵的影响

张娇娇，李珊珊，白彦福，闫 琦，丁路明*

(1.兰州大学 草地农业生态系统国家重点实验室,兰州大学 生命科学学院，甘肃 兰州730000；2.兰州大学 草地农业生态系统国家重点实验室，兰州大学 草地农业科技学院，甘肃 兰州730000)

我国是一个人口大国，畜禽产品需求量大，然而我国人均耕地面积少，蛋白质资源缺乏，远不能满足畜禽的需要，所以合理利用已有的蛋白资源和寻找新型蛋白替代饲料显得尤为重要，自从1891年首次Zumts发现非蛋白氮(NPN)能代替日粮中的粗蛋白，NPN作为反刍动物添加剂已经受到动物营养学家的广泛关注[1-3]。NPN类物质主要有三大类：尿素及其衍生物、氨及铵盐、酰胺化合物，因其为化工产品，能够大批量生产，成本较低，可节约部分蛋白饲料，降低饲料成本，因而逐渐在生产中推广使用，尿素因其经济性和有效性而被更广泛应用。为防止反刍动物氨中毒，提高尿素利用的安全性和有效性，目前尿素主要以缓释尿素的形式应用于反刍动物日粮中，本试验研究所用的NPN即是糊化淀粉缓释尿素。目前我国对各类反刍动物日粮中NPN的添加量尚未有一个统一的标准，为防止反刍动物氨中毒，肉牛日粮中NPN的饲喂量可以为日粮干物质的1.0%～1.5%[4]，而尿素在成年牛日粮中的比例一般不能超过2%[5]，本试验中缓释尿素的添加比例参照此标准，旨在利用人工瘤胃体外发酵法探究不同缓释尿素添加比例的体外发酵特点和差异，选择出最适宜的缓释尿素添加比例及其各项瘤胃发酵指标间的联系。

1 材料与方法

1.1 试验动物与日粮

试验选取2头12月龄，体重220 kg的健康秦川牛×西门塔尔杂交肉牛(西杂牛)作为瘤胃液供体。瘤胃液供体牛栓系饲养，每日7:00 h和18:00 h饲喂，自由饮水。瘤胃液供体牛日粮组成及营养水平见表1。

1.2 饲料样品处理

本试验以缓释尿素添加水平分别为0%、1%、1.5%和2%，试验用缓释尿素为糊化淀粉缓释尿素(兴牧，河北)，精粗比为30∶70的全混合日粮为试验材料，四种日粮组成及营养水平见表2，饲料样品风干后粉碎过1 mm网筛备用。准确称取(0.4 g±5 mg)饲料样品于长5 cm、宽2 cm的自制尼龙袋(300目)中，每组4个重复。发酵72 h后，将装有底物的尼龙袋放进冰水中终止发酵反应,采集完所有的尼龙袋后,在25～39 ℃的温水中洗涤尼龙袋,用玻璃棒不断搅拌,不断换水直至洗涤用水无色为止,晾干,带回实验室分析体外干物质发酵降解率(IVDMD)。

表1 试验动物饲粮组成及营养水平Table 1 Diet composition and nutrition level of experimental animals

1.3 体外培养产气法

体外培养的人工瘤胃液配置方法参考Menke[6]的方法进行，使用西德生产的100 mL的玻璃注射培养管，最小分度1 mL。注射培养管前端连接有5 cm左右的乳胶管，乳胶管上配套有止水夹，起到密封的作用。采用智能恒温水浴箱作为体外发酵的恒温控制装置。体外发酵试验前一天将注射培养管在39 ℃预热的状态下，给注射器活塞涂抹适量的凡士林以便密封。并将涂抹好凡士林的注射培养管39 ℃恒温过夜备用。将尼龙袋送入注射器前端，并将不加饲料样的注射器作为空白对照。于上午09:00使用自制瘤胃软导管分别采集两头瘤胃液供体牛瘤胃液300 mL，经四层纱布过滤后一部分分装入3个10 mL离心管中投入液氮罐带回实验室低温储存，测定瘤胃液原样指标，一部分过滤到39 ℃预热的保温瓶中，并混合均匀。将瘤胃液与人工唾液以2∶1的比例混合均匀，用磁力搅拌器搅拌，同时通入无氧CO2。体外培养操作步骤参照米见对[7]的方法进行。培养发酵开始后记录0、2、4、6、8、10、12、24、48 h和72 h的产气量，并于12、24、48 h和72 h用10 mL注射器从发酵注射器前端乳胶管处采集发酵气体于5 mL真空采血管中，用于测定发酵气体中甲烷含量。采集气体后从注射器前端将气体推出，为下一时间段发酵气体腾出空间。72 h发酵结束后，立即测定瘤胃液pH，并将瘤胃液分装于10 mL离心管中，投入液氮罐带回实验室低温保存，以备测定其铵态氮(NH3-N)和挥发性脂肪酸(VFA)含量。发酵液中NH3-N的测定使用次氯酸钠-苯酚分光光度计(日立，日本)比色法，VFA的测定使用气相色谱仪测定(北分瑞丽，北京)。

1.4 产气量计算

每个样品各时间点的产气量由以下公式计算：0～12 h的产气量计算公式为：GP=(V-V0-GP0)/M。式中：GP 为某个样品在t时刻的产气量(mL/g，DM)；V为t时刻样品培养管读数(mL)；V0为0时刻样品培养管读数(mL)；GP0为t时刻空白培养管产气量平均值(mL)；M为绝干基础样品质量；12、24、48 h和72 h采集并放空气体后，记录注射器刻度，产气量计算方法与上面相同。

1.5 产气规律拟合

采用Orskov等[8]提出的数学模型dp=a+b(1-e-ct)对0～72 h产气规律进行拟合。式中：dp(mL)是t时刻的产气量，a(mL)是快速降解部分的产气量，b(mL)是慢速降解部分的产气量，c(%/h)是慢速降解部分的产气速率，a+b(mL)是理论总产气量，t(h)是发酵的时间。

1.6 统计分析

应用SPSS20.0进行ANOVA方差分析和LSD多重比较，数据表示为平均值。

2 结果与分析

2.1 不同缓释尿素添加比例对体外发酵产气的影响

由表3可知，发酵后2 h，2%添加组产气量显著低于0%添加组(P<0.05)，而1%和1.5%添加组与各组差异不显著(P>0.05)。发酵后4～8 h，0%和1%添加组产气量显著高于1.5%和2%添加组(P>0.05)，而0%和1%添加组及1.5%和2%添加组差异不显著(P>0.05)。发酵后10 h，1%添加组产气量显著高于其余各试验组(P<0.05)，0%添加组显著高于2%添加组(P<0.05)，而1.5%添加组与0%和2%添加组差异不显著(P>0.05)。发酵后12 h，1%添加组产气量显著高于其余各试验组(P<0.05)，而0%、1.5%和2%添加组间差异不显著(P>0.05)。发酵后24 h，1%添加组显著高于0%添加组(P<0.05)，而1.5%和2%添加组与各组之间差异不显著(P>0.05)。发酵后48和72 h，0%添加组显著低于其余各试验组(P<0.05)，而其余各试验组差异不显著(P>0.05)。0%添加组的快速降解部分的产气量(a)显著高于2%部分的产气量(P<0.05)，而1%和1.5%添加组与各组差异不显著(P>0.05)。0%添加组的慢速降解部分的产气量(b)和理论最大产气量(c)显著低于其余各试验组(P<0.05)，而其余各试验组间差异不显著(P>0.05)。

表2 体外发酵日粮组成及营养成分Table 2 Diet composition and nutrient composition

表3 不同缓释尿素添加比例对体外发酵累计不同时间产气量及产气系数的影响Table 3 Effect of different proportion of slow release urea on gas production rate and gas production coefficient of in vitro fermentation

2.2 不同缓释尿素添加比例对体外发酵产甲烷的影响

由表4可知，发酵后0～12 h的产气中，随着缓释尿素添加比例的升高，甲烷产气量呈现先显著升高后显著降低的趋势，1.5%添加组甲烷产量显著高于其余各试验组(P<0.05)。发酵后12～24 h，1.5%添加组显著高于2%添加组(P<0.05)，而0%和1%添加组与各组差异不显著(P>0.05)。发酵后24～48 h，1%添加组显著低于1.5%和2%添加组(P<0.05)，而0%添加组与各组间差异不显著(P>0.05)。发酵后48～72 h，2%添加组显著高于各试验组(P<0.05)，1.5添加组显著高于1%添加组(P<0.05)，而0%添加组与1%和1.5%添加组差异不显著(P>0.05)。1%添加组总甲烷产量显著低于1.5%添加组(P<0.05)，而0%和2%添加组与各组间差异不显著(P>0.05)。

表4 发酵不同阶段的甲烷产气量Table 4 Methane production at different stages of fermentation

2.3 不同缓释尿素添加比例对日粮消化率及72 h后发酵液指标的影响

由表5可知，1%添加组的日粮降解率显著高于0%和2%添加组(P<0.05)，1.5%和2%添加组的消化率显著高于0%添加组(P<0.05)，而1.5%添加组与1%和2%添加组间差异不显著(P>0.05)。1%添加组pH显著低于其余各试验组(P<0.05)，而其余各试验组间差异不显著(P>0.05)。各处理组间NH3-N浓度、乙酸、丙酸、丁酸差异不显著(P>0.05)。1%添加组的异丁酸显著高于其余各试验组(P<0.05)，0%添加组显著高于2%添加组(P<0.05)，而1.5%添加组与其差异不显著(P>0.05)。

表5 不同日粮消化率及72 h后发酵液指标Table 5 Digestibility of different diets after fermentation

3 讨 论

3.1 不同缓释尿素添加比例对体外发酵产气的影响

体外发酵产气量是评价反刍动物瘤胃发酵的重要指标，它综合反映饲料的可发酵程度，表现了瘤胃微生物活动的总体趋势，是反映饲料营养价值的综合指标，饲料的可发酵程度越强，瘤胃微生物的活性越高，产气量就越多[9]。本试验结果中，1%添加组产气量始终显著高于其余试验组，这表明1%添加组饲料的可发酵程度、蛋白价值、微生物的活性较高，这是因为胃微生物活性受饲料能量和蛋白综合影响，是能氮平衡的反应。底物的可降解程度越高，瘤胃微生物的活性也越高，对底物的降解程度增加，产气量也越大，底物的降解率与产气量呈正比。故1%添加组底物较其余各组有较高的降解率和产气量。0%添加组在发酵后前8 h产气量显著高于1.5%和2%添加组，而发酵24 h后0%添加组产气量显著低于1.5%和2%添加组，此结果与使用方程dp=a+b(1- e-ct)拟合出来的结果一致，这可能是因为发酵初始阶段1.5%和2%添加组缓释尿素具有较高的pH，抑制了瘤胃微生物的活性，进而抑制了饲料中可溶性营养成分的降解，所以产气较少，随着发酵时间的延长，缓释尿素在瘤胃微生物脲酶的作用下释放出的NH3-N被瘤胃微生物利用，提高了瘤胃微生物的活性并促进了饲料氮与能量的协同利用，所以呈现出本试验的产气量变化规律。

3.2 不同缓释尿素添加比例对体外发酵产甲烷的影响

甲烷是除CO2外最主要的温室气体之一，反刍动物呼吸和饲料发酵排放的甲烷在温室气体清单中占较大的比重[10-11]，缘于反刍动物瘤胃中的产甲烷菌能有效地将细菌和真菌分解饲料有机物产生的H2和甲酸、甲醇、甲胺及乙酸等含有甲基的初级发酵产物转化为甲烷，并以此获得其生长所需要的能量。本试验中各组甲烷产气量随发酵时间的延长，呈现先升高后降低的趋势，这是因为随着发酵的进行，底物产气速率降低，产气量减少。反刍动物胃肠道产生甲烷是必须的过程，不能被完全清除，但是可以通过改善饲料消化率和均衡营养等方式减少甲烷排放[12]，本试验中试验各组能氮相同，但1%添加组在各时间阶段的甲烷产气量和总甲烷产气量较其余各试验组低，表明1%添加组后备奶牛对日粮具有较高的利用率，摄入的能量以甲烷形式损失的较少。

3.3 不同缓释尿素添加比例对日粮消化率及72 h后发酵液指标的影响

饲料降解率是反映饲料利用效率的重要指标，谭支良等[13]在用体外法研究不同来源的氮和碳水化合物对体外干物质降解率的影响研究中发现，适当比例的尿素添加能够显著提高体外干物质降解率，而过量补充尿素会抑制体外干物质的降解率，本试验结果中1%添加组饲料降解率显著高于其余各试验组，之后随着缓释尿素添加比例的增加，饲料降解率降低，此结果与其研究结果一致。瘤胃液pH值是反映瘤胃发酵状态的一个重要指标，正常成年反刍动物瘤胃pH维持在6～7之间，pH低于6.0时将严重抑制日粮纤维的消化，本试验中pH变化范围在6.79～6.89，属于正常变化范围。马陕红等[14]对非蛋白氮的模拟瘤胃体外发酵的研究发现，日粮中瘤胃可消化蛋白水平能够显著提高瘤胃内pH，本试验结果中1%添加组的pH显著低于其余各试验组，这是因为1%添加组饲料消化率高，碳水化合物以甲烷形式浪费的较少，产生更多的挥发性脂肪酸所致(表5)。瘤胃液中NH3-N浓度是反映瘤胃氮代谢的重要指标之一，NH3-N除了是瘤胃内氮代谢过程中外源(日粮)蛋白质以及内源含氮物质降解的主要产物，还是能量和碳源存在的条件下，合成瘤胃微生物菌体蛋白的原料，其浓度高低可反映日粮蛋白降解情况和微生物合成菌体蛋白的效率[15-16]。本试验中各组瘤胃液NH3-N浓度差异不显著，但各组间NH3-N浓度呈现和pH相同的变化趋势，这是因为1%添加组NH3-N在能量和碳源存在的条件下合成微生物菌体蛋白的效率较高，降低了发酵液中的NH3-N浓度。瘤胃液VFA是有机物在瘤胃中发酵的主要产物，是反刍动物维持其正常新陈代谢的主要能源物质和体内进行脂肪合成的重要底物，其含量及组成比例是反映瘤胃消化代谢活动的主要指标之一，本试验结果中各试验组TVFA、乙酸、丙酸、丁酸含量差异不显著，但是TVFA有随缓释尿素添加先升高后降低的趋势，并在1%添加组达到最大值，表明1%缓释尿素添加组发酵管中消化代谢活动最活跃，能够为反刍动物育肥提供丰富的脂肪合成底物。

尿素是脲酶的诱导物，进入瘤胃中的尿素越高，脲酶活性就越高，在瘤胃中释放的氨越多，而氨溶于水呈碱性，所以会使瘤胃液pH升高[5,17]，在以往的研究中，研究人员发现随着日粮天然蛋白含量和日粮中非蛋白氮用量的增加，会使瘤胃中NH3-N的浓度和pH升高，同时使非蛋白氮利用率降低[5,14]，而本试验随着缓释尿素添加比例的升高，在缓释尿素添加比例为1%时发酵液NH3-N的浓度和pH都出现了降低的趋势，同时底物降解率、产气量、挥发性脂肪酸产量都在1%添加组达到最大值，而甲烷产量在1%添加组最低，这是因为在1%缓释尿素添加组在脲酶作用下底物中释放的氮与能量利用的同步性较高，瘤胃微生物增殖和发酵活动活跃，产生更多的微生物蛋白，底物能量以甲烷形式浪费的较少，所以底物降解率、产气量和挥发性脂肪酸产量都在此时达到最大值。

4 结 论

用体外发酵法对日粮中添加不同比例缓释尿素的研究发现，1%的缓释尿素添加能够显著提高底物降解率和发酵液挥发性脂肪酸含量，并显著降低甲烷产量，减少温室气体排放。综合经济利益和环境角度考虑，实际生产中西杂牛日粮中缓释尿素的添加比例为日粮干物质的1%最合适。

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