三江黄牛DKK1、DKK4和MyoG基因遗传多态性分析

郭 琳，柴志欣，钟金城*，何世明，吴锦波，蹇尚林，冉 强

(1. 西南民族大学 青藏高原研究院，成都 610041；2. 阿坝州畜牧科学研究所，四川 汶川 623000;3. 阿坝州畜牧工作站，四川 汶川 623000)

三江黄牛主产于四川省汶川县的三江、白石、水磨、映秀和漩口等乡镇，其中属三江乡数量最多，三江乡位于汶川县西南部，地势开阔平坦，河流支流丰富，实属天然牧场。三江黄牛是役肉兼用型地方优良品种，屠宰率43%，净肉率31%，被村民称为“土拖拉机”，其体形大，身体长、腿粗大有力、性驯善、耐粗饲、耐高寒、抗病力和适应性强、肉质好、持久力好[1]，但也存在生长速度较慢、胴体率低等缺点。近年来，随着当地经济社会的发展和农业结构转型，以及汶川地震的发生，导致三江黄牛产区功能布局空间受限，使现有养殖规模萎缩、三江黄牛数量不断下降，已濒临灭绝，做好三江黄牛的保种选育工作显得尤为重要。

DKK1是Dickkopf蛋白家族(DKKs)成员之一，是1998年A.Glinka等首次在非洲爪蟾胚胎细胞中发现的[2]。DKK1蛋白是一种分泌型糖蛋白，能够与细胞膜上 Wnt受体蛋白 5(LRP5)/LRP6和共受体Kremen1/Kremen2结合，形成三元内吞小体，阻断Wnt信号通路，从而参与动物骨骼发育及脂肪形成[3-4]。DKK4也是DKKs成员之一，含有两个富含半胱氨酸区域的分泌型糖蛋白，也是构成Wnt拮抗剂的重要成分之一，与DKK1蛋白的作用机制相似。肌细胞生成素(MyoG Myogenin)基因是MyoD基因家族中唯一在所有骨骼肌细胞中均可表达的基因，调控中胚层细胞分化为成肌细胞、再由成肌细胞融合成肌纤维[5]，影响着骨骼肌的发育。三江黄牛作为优良的地方品种，对其经济性状的研究尚未见报道，而研究肉质性状和生长性状是选育工作的重要参考指标。相关研究显示，DKK1、DKK4、MyoG基因在骨骼发育和骨平衡中也发挥重要作用，是骨再塑的重要调控因子。本研究选取即影响动物骨骼发育又对肉质性状具有显著作用的DKK1、DKK4 、MyoG基因，以三江黄牛为研究对象，筛选候选基因的SNP位点，为开展三江黄牛资源的保存与利用、功能基因的定位提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验动物

在四川省阿坝藏族羌族自治州汶川县三江镇选取健康成年三江黄牛共100头，从中挑选年龄一致(3岁龄)、膘情相近的个体30头用于试验，采集耳组织，75%乙醇保存带回实验室，-80 ℃保存备用。

1.2 基因组DNA提取及检测

采用动物组织基因组DNA提取试剂盒(天根生物技术有限公司)提取基因组DNA，用1%琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计分别检测DNA的纯度和浓度，-20 ℃保存备用。

1.3 引物设计和PCR扩增

参考GenBank中牛DKK1基因(AC_000183)，牛DKK4基因(AC_000184)及牛MyoG基因(AC_000173)序列，采用交叉重叠原理，用Primer Premier6.0软件设计特异性引物，引物设计均覆盖整个基因(表2)，引物由英潍捷基(上海)生物技术有限公司合成。

PCR反应体系(50 μL)， 其中DNA模板1 μL，上下游引物各2 μL，dd H2O 19 μL、Premix Ex Taq 聚合酶25 μL。PCR反应条件：94 ℃预变性4 min；94 ℃ 变性30 s，(退火30 s，72 ℃延伸)具体见表1，共30个循环；72 ℃延伸5 min，4 ℃保存。PCR产物用10%凝胶电泳进行检测，用DNA胶回收试剂盒(TaKaRa)进行纯化、回收，将纯化产物送往英潍捷基(上海)生物科技有限公司进行双向测定。

表1 引物信息Table 1 Information of primer

1.4 SNP位点的筛查与数据统计分析

利用BioEdit7.0.5软件对扩增序列与参考序列进行比对。利用直接测序法检测筛查的双峰位点，利用以上软件对所测序列进行比对，筛查SNP位点，并交由公司测序判定基因型。根据检测结果，统计不同基因型个体数量。利用PIC_CALC、Popgen32、SPSS17.0等软件分析基因频率、基因型频率、多态信息含量、有效等位基因数、基因纯合度及杂合度。

2 结果与分析

2.1 DKK1、DKK4 、MyoG基因SNP位点

DKK1基因不同引物扩增片段与预期长度一致。利用BioEdit 7.0.5生物软件查找双峰位点，对测序获得SNP位点进行校对。PCR扩增产物测序结果显示，三江黄牛DKK1基因存在2个单核苷酸突变位点(A1051G、G1152T)均位于内含子中，序列分析可知 A1051G位点包括AA、GA、GG三种基因型，G1152T位点基因型为GG、GT和TT(图1)。DKK4基因存在2个单核苷酸突变位点，位点C1949T包括AG、GG和AA三种基因型，位点C1749T的两种基因型分别为TC和CC基因型(图2)。三江黄牛MyoG基因测序结果未检测到SNP位点。

2.2 基因型频率、基因频率

三江黄牛DKK1、DKK4基因SNP位点基因型频率和基因频率见表2。由表2可以看出，在位点A1051G中， AA、GG和AG的基因型频率分别为0.13、0.50和0.37，GG型为优势基因型；G1152T位点，GG和TT基因型频率为0.33和0.17，GT型为0.50，为优势基因型。在两个突变位点中等位基因G均为优势等位基因。

图1 三江黄牛DKK1基因SNP筛查及基因分型图Fig.1 SNP screening and genotyping of sequencing of DKK1 gene in Sanjiang Yellow Cattle

图2 三江黄牛DKK4基因SNP位点测序及分型图Fig.2 SNP screening and genotyping of sequencing of DKK4 gene in Sanjiang Yellow Cattle

表2 三江黄牛DKK1、DKK4基因SNP位点 基因型频率和基因频率Table 2 Genotype allele and frequencies of SNP sites in DKK1 and DKK4 gene

三江黄牛DKK4基因C1949T位点，CT、CC和TT基因型频率为0.53、 0.27和0.20；位点C1749T，CC为优势基因型。C1949T和C1749T等位基因C均为优势等位基因，频率分布分别为0.53和0.85。

2.3 群体多态性及χ2适合性检验

对三江黄牛DKK1基因SNP位点进行卡方适合性检验，A1051G、G1152T位点卡方值为0.7001，0.0245，均未达到显著水平(P>0.05)，群体处于Hardy-Weinberg平衡状态。三江黄牛DKK1基因SNP位点多态信息含量均为中度多态(0.25

三江黄牛DKK4基因多态位点符合Hardy-Weinberg平衡(P>0.05)，在长期进化过程当中达到了群体遗传平衡。C1949T位点为中度多态(0.25

3 讨 论

中国黄牛品种多且分布广泛，主要分布于全国29个省、市、自治区和直辖市，分为北方黄牛和南方黄牛[6]。三江黄牛作为南方黄牛的一种，以其良好的役用性、优质的肉用性，作为优良地方品种为当地经济社会的发展发挥重要作用。现今，由于三江黄牛养殖规模萎缩，数量不断下降，现存栏量仅2000多头，已濒临灭绝，因此，开展三江黄牛种质资源研究，做好保种工作显得尤为重要。目前，对三江黄牛的研究主要集中在遗传多样性方面，而对其经济性状的研究较少。陈智华等[7]通过对三江黄牛Bola-DRB3基因第2外显子进行PCR-RFLP 多态性分析，发现三江黄牛该基因存在7种基因型，遗传多样性丰富。汪琦等[8-9]、宋娜娜等[10]通过对三江黄牛mtDNA D-loop、cytb、RAPD以及全基因组测序研究发现其遗传多样性丰富。相关研究显示，DKK1、DKK4 及MyoG基因作为影响骨骼生长发育的重要候选基因，在调控肢体骨骼发育，影响生长发育及肉质性状等方面均发挥重要作用。高建斌等[11]通过对秦川牛DKK1基因SNP位点筛选及关联分析，发现其在内含子及外显子区共存在5个突变位点，且部分突变位点与秦川牛体尺性状及肉质性状显著相关。曹贵玲等[12]研究发现山羊DKK1基因全长3491 bp，有4个外显子和3个内含子构成，位于启动区的多态位点与其生产性状无显著关联。高建斌等[11]报道显示秦川牛DKK4基因外显子区段共检测到5个SNP位点，其中位于第二外显子的G65A位点在体斜长、腰角宽、胸围和坐骨端宽指标存在极显著差异(P<0.01)，尻长指标存在显著差异(P<0.05)。朱超杰等[13]利用PCR-SSCP技术对草原红牛、延边黄牛、红安格斯×西门塔尔及利木赞×西杂牛4个群体的MyoG基因外显子1进行多态性比较分析，发现存在AA、AB及BB三种基因型，其中前两种占多数，BB基因型数量较少。韩银仓等[14]发现河南县欧拉型藏羊、祁连县高原型藏羊和贵南县黑藏羊MyoG基因外显子1存在SNP，关联性分析显示河南县欧拉羊群体中CC基因型个体的体重、体高和体长显著相关。

表3 三江黄牛DKK1、DKK4基因SNP位点的遗传多态性Table 3 Genetic polymorphism of SNP sites of DKK1 and DKK4 gene

本研究主要利用DNA池直接测序技术对三江黄牛DKK1、DKK4 及MyoG基因进行SNP位点筛查。三江黄牛DKK1、DKK4基因均检测发现2个SNP位点，其中DKK1、DKK4基因中SNP位点均符合Hardy-Weinberg平衡(P>0.05)，说明位点受基因突变、人工选择等因素影响较小，适应性好，利于品种优良基因的保存，以上位点在三江黄牛中的选择空间较大，应加大人工选择的强度。且 SNP位点纯合度均大于0.5，与高建斌等[11]对秦川牛DKK1基因SNP位点筛选分析结果一致。三江黄牛MyoG基因未检测到多态位点，这与杨漫漫等[15]对皖东牛和广丰牛MyoG基因PCR-RFLP检测发现外显子区域存在酶切多态位点的结果存在差异，皖东牛是2011年安徽省审定的地方黄牛品种，与三江黄牛均属于优良的地方黄牛品种，因皖东牛与三江黄牛生活环境存在较大差异，且遗传基础不同，也可能导致结果存在差异。通过宋娜娜等[16]对三江黄牛全基因组数据的分析，挖掘影响三江黄牛经济性状、生长性状的关键候选基因及SNPs位点。

目前，三江黄牛纯种存栏数仅2000多头，濒临灭绝，地方政府及畜牧工作站正在积极调整三江黄牛产区布局，实行奖补机制，鼓励养殖户扩大养殖规模，建立健全三江黄牛遗传资源保种选育机制，使该优良地方品种数量得以恢复。同时，三江黄牛存在生长速度慢、胴体率低等缺点，依此本研究筛选了DKK1、DKK4 及MyoG与生长及骨骼发育相关基因进行SNP位点筛查，但因采样时为夏季，牛群在较远的夏季牧场，致使采样数量较少不足以代表整个群体的发育情况，且没有进行体尺性状指标的测定及关联性分析，在接下来的研究中要进一步加大样本量，并进行关联性分析，为三江黄牛经济性状的遗传改良提供理论依据和数据支持。

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