补肾通络方对膝骨关节炎大鼠氧自由基的影响

杨 帆，侯秀娟，袁 芳，朱跃兰

(1. 北京中医药大学，北京 100029；2. 北京中医药大学东方医院，北京 100078；3. 首都医科大学附属北京中医医院，北京100010)

膝骨关节炎(KOA)是一种常见的退行性关节病变，具有渐进性破坏的特点，致残率极高。其主要特点是关节软骨进行性磨损破坏、关节边缘及软骨下骨反应性增生、形成骨赘，同时可伴有不同程度的滑膜炎表现，主要临床表现是缓慢进展的关节疼痛、压痛，伴有僵硬、肿大、活动受限，严重者会导致关节功能障碍甚至残疾。其发病可能与遗传、性别、年龄增长、体质量增加及创伤、炎症等多种因素有关[1]。氧自由基指标中超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)和过氧化脂质(LPO)的含量可以反映出组织内氧自由基的生成及分解情况，监测这些指标的水平变化可判断软骨组织的破坏情况[2-3]。补肾通络方具有补益肝肾、活血通络的作用，在临床上治疗膝骨关节炎疗效很好。本实验旨在通过观察补肾通络方对膝骨关节炎大鼠血清SOD、MDA和LPO含量的影响，探讨该方治疗膝骨关节炎的作用机制。

1 实验资料

1.1实验动物 健康清洁级雄性Wistar大鼠42只，体质量180～220 g，由斯贝福(北京)生物科技股份有限公司提供，许可证号：SCXK(京)2016-0002。大鼠饲养于中国中医科学院医学实验中心的清洁级环境中，环境温度为(26±1)℃，水瓶给水，自由进食，普通饲料喂养。适应性喂养1周后进行实验。

1.2主要试剂与器材 木瓜蛋白酶(北京索莱宝科技有限公司提供，25 g/瓶)，生理盐水(石家庄四药有限公司，500 mL/瓶)，SOD、MDA、LPO ELISA试剂盒(北京欧北生物科技有限公司提供)，电子天平[赛多利斯科学仪器(北京)有限公司提供]，Centrifuge 5810R(Eppendorf AG公司提供)。

1.3实验药物 美洛昔康片(上海勃林格殷格翰药业有限公司，国药准字H20090789，7.5 mg/片)；抗骨增生胶囊(江苏康缘药业股份有限公司，国药准字Z10980006，0.35 g/粒)；补肾通络方(原药材每剂含量：骨碎补9 g、桑寄生15 g、川牛膝12 g、鸡血藤15 g、白芍12 g、穿山龙15 g、川芎10 g，由北京中医药大学东方医院药房提供，制成颗粒后每剂药质量为10 g)。灌胃剂量根据大鼠与人的体表面积比值进行换算[4]。

1.4分组、造模及干预 按照随机数字表法将42只雄性Wistar大鼠随机分为正常组、模型组、西药组、中成药组、补肾通络方低剂量组、补肾通络方中剂量组和补肾通络方高剂量组，每组6只。除正常组大鼠外，其余组大鼠均参照文献[5]方法造模：于大鼠双侧后肢膝关节腔内注射4 %木瓜蛋白酶溶液0.2 mL/肢，第1，4，7天各1次。大鼠常规饲养，末次注入木瓜蛋白酶溶液后第2天，随机选2只大鼠对其行双侧膝关节X射线检查，以确定造模是否成功。确认造模成功后第2天，西药组给予美洛昔康0.781 mg/kg混悬液灌胃，中成药组给予抗骨增生胶囊0.547 g/kg混悬液灌胃，补肾通络方低、中、高剂量组分别予补肾通络颗粒方0.52，1.04，2.08 g/kg混悬液灌胃(10 g颗粒方相当于88 g原药材)，正常组及模型组均给予等体积蒸馏水灌胃，均每天1次，连续灌胃4周。

1.5标本采集及检测 各组大鼠于实验结束后采用10%水合氯醛0.3 mL/100 g腹腔注射麻醉后，经腹主动脉取血，约8mL/只，室温下静置2h后，以3 000 r/min转速离心15 min，分离留取上层血清，分装于离心管内，做好标记后置于-80 ℃冰箱保存备用，利用ELISA法按试剂盒提供的操作流程，分别测定血清中SOD、MDA、LPO含量。

2 结 果

2.1大鼠造模前后膝关节X射线表现 造模前胫骨平台及股骨髁骨面光滑平整，关节间隙大小适中，关节边缘整齐规则无骨赘，关节内无游离体，软骨下骨密度分布均匀，见图1及图2。造模后胫骨平台骨面欠光滑，略有不平整，且关节间隙较造模前有所变窄，见图3及图4。

2.2各组大鼠血清中SOD、MDA和LPO含量 模型组大鼠血清中MDA和LPO含量均明显高于正常组(P均<0.05)，SOD含量低于正常组(P<0.05)。各给药组大鼠血清中MDA和LPO含量均明显低于模型组(P均<0.05)，西药组和中成药组SOD含量均明显高于模型组(P均<0.05)，补肾通络方各剂量组SOD含量与模型组比较差异无统计学意义(P均>0.05)。补肾通络方中剂量组血清中MDA和LPO含量在3组之间最低，SOD的含量最高，但3组之间比较差异均无统计学意义(P均>0.05)。补肾通络方高剂量组血清中MDA和LPO含量明显高于西药组(P均<0.05)，且LPO含量明显高于中成药组(P<0.05)。见表1。

图1 造模前大鼠右膝关节矢状位X射线影像

图2 造模前大鼠左膝关节矢状位X射线影像

图3 造模后大鼠右膝关节矢状位X射线影像

图4 造模后大鼠左膝关节矢状位X射线影像

表1 各组大鼠血清SOD、MDA和LPO含量比较

注：①与正常组比较，P<0.05；②与模型组比较，P<0.05；③与补肾通络方高剂量组比较，P<0.05。

3 讨 论

骨关节炎是以关节僵硬、肿痛及活动困难为主要表现的一种常见病，多见于中老年人，是最常见的慢性退行性关节病损，又称退行性骨关节病、肥大性骨关节病和老年性骨关节病。据统计，60岁以上人群中患病率达50%，75岁以上人群中患病率高达80%，本病致残率也可达到53%[6]。但当前对于骨关节炎的具体发病机制仍不是十分清楚，临床上也无治愈本病的明确方法。既往研究发现，关节软骨由于不同诱因发生磨损导致性状改变，进而软骨代谢异常，造成软骨细胞破坏产生大量氧自由基，各种因素同时作用加重软骨细胞的损伤、老化等，使关节出现进行性的退行性改变[7-8]。

骨关节炎在中医中属于“痹病”“骨痹”的范畴，以肌肉、筋骨、关节发生酸痛，麻木，屈伸不利，甚或关节肿大灼热等为主要临床表现。如《灵枢·刺节真邪篇》：“虚邪之中人也，洒淅动形，起毫毛而发腠理，其入深，内搏于骨，则为骨痹。”本病常见于中老年人，系年迈体弱、正气耗损、气血不足，若复感外邪，气郁痰滞血瘀阻于经络而发病，主要涉及肝、脾、肾三脏[9-10]。《类证治裁·痹证》有云：“诸痹……良由营卫先虚，腠理不密，风寒湿乘虚内袭。正气为邪阻，不能宣行，因而滞留，气血凝滞，久而成痹。”表明其病机为正虚邪留，气血凝涩不通，虚实夹杂，以肝肾亏虚为根本，痰瘀阻络为标实。因此治疗上以补益肝肾为主，配合活血通络[11]。补肾通络方是朱跃兰教授多年治疗骨关节炎的经验方，具有补益肝肾、通经活络之功效，可明显改善肝肾亏虚、瘀血阻络所致的关节疼痛、屈伸不利、行动不便等。近年研究表明，本方具有抑制膝骨关节炎模型大鼠血清中炎性细胞因子、调节膝关节软骨含水量作用，进而改善疼痛、肿胀、活动受限等症状[12-14]。

目前研究表明，软骨细胞的破坏、衰老与氧自由基的关系极为密切，氧自由基作用于细胞脂膜，攻击其中的多不饱和脂肪酸(PUFA)，引发脂质过氧化反应，产生LPO，而它又正反馈攻击生物膜和亚细胞器，使细胞膜产生更大的损伤，形成一系列恶性循环；同时诱使进一步产生连锁增殖反应，最终形成稳定的降解产物MDA[15-16]。由于LPO和MDA都是氧自由基作用后过氧化反应的产物，因此检测血清中LPO和MDA的含量就可以反映脂质过氧化反应的程度。而SOD是一种活性蛋白酶，能催化氧自由基转变成为H2O2和O2，是一种重要的氧自由基清除酶，通过清除软骨损伤产生的氧自由基而保护软骨，缓解软骨进一步被破坏的过程[17-18]。因此，SOD的含量变化可以反映治疗手段对骨关节炎是否有效。提高SOD含量，降低MDA和LPO含量，能够减少氧自由基产生，减缓过氧化反应，抑制软骨破坏，延缓骨关节炎的病程进展[19-20]。

本实验结果显示，模型组中MDA和LPO含量明显高于正常组，SOD含量明显低于正常组，说明氧自由基参与了骨关节炎的发病。而经补肾通络方干预后，MDA和LPO含量明显下降，SOD含量明显升高，说明本方能够清除氧自由基；其中补肾通络方中剂量组各指标改善更明显，说明该浓度在此次实验动物的药物治疗监测中为最佳浓度；而补肾通络方不同剂量组之间差异无统计学意义，可能考虑与实验动物数量较少有关，有待进一步研究。

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