坍塌反应调节蛋白2在膀胱尿路上皮癌中的表达及其与预后的相关性

程倩， 杨建昆， 杜晓媛

（1.锦州医科大学 附属第一医院 病理学教研室，辽宁锦州121000；2.南方医科大学第三附属医院，广东广州510630）

坍陷反应介导蛋白（collapsing response mediator proteins，CRMPs）又称 TUC（TOAD-64、Ulip、DRP），是大脑发育过程中高度表达的胞质磷酸蛋白，最初是在Sema3信号研究和神经分化研究中发现的［1-4］.近来，越来越多的研究显示，CRMPs与肿瘤的发生、进展以及疾病预后密切相关.CRMP2作为CRMPs家族成员中的重要成员，已经发现其具有多种细胞生物学功能.前期研究已证实CRMP2在结肠癌、非小细胞肺癌和乳腺癌中均高表达，提示CRMP2可能是肿瘤发生进展的重要基因.因此，本研究检测CRMP2在非肌层浸润性膀胱尿路上皮癌中（Non-muscle invasive bladder cancer，NMIBC）的表达水平，分析其与临床病理特征的相关性，探讨其在肿瘤复发、进展及生存时间中的预测价值，为膀胱尿路上皮癌预后评估提供新的判断依据，并为膀胱癌个性化治疗提供新的可能的治疗靶标，具有十分重要的临床意义.

1 研究对象和方法

1.1 研究对象

回顾性收集2005年5月至2009年5月辽宁医学院附属医院及辽河油田总医院130例非肌层浸润性膀胱尿路上皮癌（NMIBC）石蜡包埋标本切片，所有患者均病理确诊为无转移的NMIBC.排除标准包括：（1）临床或病理资料不全；（2）合并其他部位肿瘤或者其他成分肿瘤（腺癌、鳞癌、肉瘤）；（3）随访资料缺失（病人在2年内失访）.平均年龄68.5岁（47～81岁），男 71例，女 59例，Ta期67例，T1期63例.15例膀胱镜检取材正常膀胱黏膜作为对照，平均年龄67岁（63～75岁），男8例，女7例.本研究申请了参与单位伦理审查委员会的审核并获得了实验批准.所有受试人员在试验前均已知情研究内容，并签署了相关知情同意书.

1.2 主要试剂及仪器

免疫组化试剂盒（凯基KGOS60），二甲苯、无水乙醇、柠檬酸钠、双氧水、苏木素、PBS粉、Triton-100，包埋机，切片机（美国Therom公司），烘干机，倒置显微镜（日本Olympus公司），Milli-Q纯水器（Millipore）.

1.3 实验方法

1.3.1 免疫组织化学技术

将切片置于烤箱中55℃1 h.3缸二甲苯，每缸各浸泡5min脱蜡.梯度酒精（体积分数分别为100%、95%、80%、75%）水化.体积分数为3%的H2O2中微波低火3 min去除内源性过氧化物酶.去离子水 I、去离子水 II各 1 min.浓度为 10 mmol/L柠檬酸钠缓冲液（PH 6.0）高压锅抗原修复，在修复液中自然冷却.去离子水I、去离子水Ⅱ各1 min.3缸PBST（PBS 200 mL+体积分数4%Triton 250μL）润洗，各 5 min.玻片甩干，擦片，免疫组化笔画圈，范围可稍大避免边缘效应.在湿盒上平铺玻片，滴加一抗兔抗人CRMP2抗体（体积比为1∶200，abcam，ab129082），4℃冷库孵育过夜.取出玻片，3缸PBST浸洗，每次5 min.甩干，擦干背侧及圈外水分，滴加二抗，37℃温箱中30 min.DAB显色，苏木素复染.梯度酒精体积分数分别为75%、80%、95%、100%）各3～5 min进行脱水.二甲苯透明后中性树胶封片.风干2～3 d.

1.3.2 染色强度评判

在不知道任何临床资料和病理资料的情况下，对免疫组化切片进行评估，本研究入选的所有患者病理玻片均由辽宁医学院病理教研室资深医师在相同条件下观察每张切片后对结果作出判断.阳性染色程度分为4级：无染色为0分（-），淡黄色定为1分（+），棕黄色评为2分（++），棕褐色则为3分（+++）.阳性细胞百分率的判断：每张切片随机地至少选取4个不同高倍镜下取视野，每个视野计数至少100个细胞，计算阳性细胞所占百分比进行评分：0分，0%；1分，1%～25%；2分，26%～50%；3分，51%～75%；4分，76%～100%［5］.每个样本的最终综合评分为染色强度评分与阳性细胞百分比之积，结果判定：0分为阴性，1～2分表示弱阳性（+），3～8分提示中度阳性（++），9～12分为强阳性（+++）.本研究以综合评分≥4分为阳性，＜4分为阴性.

1.4 随访方案

遵中华泌尿外科学会膀胱癌诊疗指南，所有病例在TURBT术后两年内每3个月行膀胱镜检查1次，3～5年每6个月行膀胱镜检查1次，此后每年1次.复发定义为膀胱镜检查或者影像学检查发现膀胱内菜花状结节，或者可疑黏膜活检证实为膀胱癌.进展定期为复发后再次手术的病理出现分级或者分期进展，影像学发现远处转移.

1.5 统计学处理

所有统计分析均采用SPSS 16.0软件.本研究主要观察终点为复发和进展.用K-M生存曲线分析各因素对NMIBC术后复发率和进展率的影响，Log-rank比较组间差异.Cox回归分析探讨观NMIBC复发和进展的独立影响因素.P＜0.05认为有统计学差异.

2 结果

2.1 病人基本资料特征与CRMP2关系

130例患者的临床病理信息详见表1.经免疫组化分析，按照课题组既定的阳性及阴性诊断标准（半定量评估方法），经两个病理学专家分析，结果显示CRMP2免疫组化染色主要定位是在细胞浆，亦有少许细胞核存在阳性表达（图1）.经统计CRMP2低度阳性表达患者共计70例，高度阳性表达共计60例.结果发现癌组织中CRMP2表达水平与患者的年龄、性别、手术方式以及肿瘤大小无明显的相关性.而CRMP2表达水平在肿瘤分级较高的膀胱尿路上皮癌组织显著高于肿瘤分级较低的膀胱尿路上皮癌组织标本（P＝0.009）.此外，复发性非肌层浸润性膀胱尿路上皮癌组织中CRMP2表达水平要显著高于无复发的非肌层浸润性膀胱尿路上皮癌组织（P＜0.01）.术后发生肿瘤进展的非肌层浸润性膀胱尿路上皮癌组织中CRMP2的表达水平显著地高于术后没有发生进展的非肌层浸润性膀胱尿路上皮癌（P＜0.01）.

表1 130例膀胱尿路上皮癌患者临床病理特征与CRMP2表达水平相关性Table 1 The clinicopathological features of 130 cases of bladder urothelial carcinoma and the relationships of CRMP2 expression level n（%）

图1 CRMP2在正常膀胱粘膜和膀胱癌组织表达免疫组化染色（IHC）代表图Fig.1 Immunohistochemical staining（IHC）expression level of CRMP2 in normal bladdermucosa and bladder cancer tissue

2.2 CRMP2表达水平与膀胱尿路上皮癌预后相关性

通过36～100个月的随访；在随访期内发生肿瘤复发的有53例（40.8%），发生肿瘤进展的有21例（16.2%）；其中14例在随访期内死亡（10.7%）.生存分析结果显示CRMP2高表达的膀胱尿路上皮癌患者复发率明显高于CRMP2低表达的患者（P＜0.001，图 2A）.而 CRMP2高表达患者的肿瘤进展率明显高于CRMP2低表达患者（P＝0.038，图2B）.CRMP2高表达患者肿瘤总体生存率明显低于CRMP2低表达患者（P＝0.024，图2C）.

图2 CRMP2表达水平与膀胱尿路上皮癌预后的相关性的生存分析Fig.2 Survival analysis of the correlation between CRMP2 expression level and the prognosis of bladder urothelial carcinoma

2.3 CRMP2是膀胱癌术后复发和进展的独立危险因素

为探讨CRMP2是否是影响患者预后的独立危险因素，课题组将观察终点设定为肿瘤复发和进展.为进一步探讨CRMP2表达水平是否是膀胱尿路上皮癌术后复发和进展的独立危险因素.首先将患者年龄、性别、手术方式、肿瘤大小、肿瘤数目、肿瘤分级、原发肿瘤病理分期和CRMP2表达水平纳入单因素分析，将单因素分析结果中有统计学意义的变量纳入多因素模型分析中.对于膀胱尿路上皮癌术后复发这一观察终点，单因素分析结果显示肿瘤分级、肿瘤数目及CRMP2表达水平与非肌层浸润性膀胱尿路上皮癌术后复发密切相关.进一步用Cox回归多因素分析显示肿瘤分级、肿瘤数目及CRMP2表达水平是非肌层浸润性膀胱尿路上皮癌术后复发的独立危险因素（表2）.对于肿瘤进展这一观察终点，单因素分析显示原发肿瘤病理分期、肿瘤数目、肿瘤分级及CRMP2表达水平与膀胱尿路上皮癌术后发生进展密切相关.进一步多因素分析显示肿瘤分级、肿瘤分期和CRMP2表达水平是非肌层浸润性膀胱尿路上皮癌术后肿瘤进展的独立危险因素（表3）.

表2 膀胱尿路上皮癌术后首次复发独立危险因素单因素及多因素分析Table 2 Univariate and multivariate factors of independent risk factors for the first recurrence of bladder urothelial carcinoma after operation

表3 膀胱尿路上皮癌术后进展的独立危险因素单因素分析及多因素模型Table 3 Univariate and mu ltivariate factors of independent risk factors for the first p rogression of bladder urothelial carcinoma after operation

3 讨论

膀胱尿路上皮癌是泌尿系统最常见的恶性肿瘤.随着现代肿瘤生物学研究的迅速进展，很多与膀胱尿路上皮癌相关的肿瘤生物分子标志物被研究和证实，初步揭示其在膀胱尿路上皮癌的早期诊断、风险评估、复发进展以及死亡中的重要作用.有些生物分子还被证实了潜在的治疗靶标，但这些膀胱尿路上皮癌标志物均存在敏感性和特异性低的问题，难以切实应用到膀胱尿路上皮癌临床诊断、预后及治疗中.

CRMPs是在Sema3信号研究和神经分化研究中发现的神经系统高度表达的胞质磷酸蛋白，该家族存在5个成员（CRMP1～CRMP5），具有很高的序列同源性，对神经生长和分化起重要作用.近年来，越来越多的研究报道CRMPs在人类肿瘤组织中差异性表达，并与临床病理特征及患者预后密切相关.CRMP1在肺癌组织中比癌旁正常组织明显低表达，CRMP1低表达提示疾病预后差，疾病进展、淋巴结转移，术后早期复发、生存时间短［5-7］.CRMP1的新异构体 LCRMP1表达也与非小细胞肺癌患者的临床结局和淋巴结转移相关.LCRMP1和CRMP1在调节癌症细胞侵袭和转移中具有相反的功能［6，8-9］.CRMP2与结直肠癌和乳腺癌进展相关［10-11］.与其他正常组织比较，CRMP2在结直肠正常组织或癌组织中高表达.结直肠癌标本中 CRMP2阳性率达 58.6%（99/169），与早期淋巴结转移密切相关，但与肿瘤远处转移和5年生存率无明显关系［10］.在乳腺癌中，CRMP2无论在mRNA还是蛋白水平均明显下调.而且，磷酸化CRMP2核内表达水平与组织恶性度和三阴乳腺癌成比例［11］.CRMP3则定位于10号染色体 q25.2-q26［12］，多种肿瘤抑癌基因也定位于附近区域［13-14］.此外，80%的成胶质细胞瘤在该染色体区域存在突变.CRMP3与恶性肿瘤的副癌神经综合征相关［12］.CRMP4在转移性前列腺癌组织中差异性表达下调，提示CRMP4是前列腺癌转移的抑制基因.通过对CRMP4启动子区域的结构进行分析发现，CRMP4启动子甲基化是导致基因表达沉默，引起前列腺癌发生转移的重要机制［15-16］.与此相反，Hiroshima等［17］对胰腺癌研究报道，CRMP4在胰腺癌中高表达并与静脉侵犯和肝转移密切相关，CRMP4是胰腺癌术后生存的独立预测因子，是胰腺癌促癌基因.CRMP5被认为与副癌综合征密切相关，研究发现98.6%的高级别神经内分泌肺癌（小细胞肺癌和大细胞神经内分泌肺癌）标本中CRMP5广泛高表达［18］.成神经胶质细胞瘤CRMP5高表达患者术后生存时间还不及CRMP5低表达患者的一半［19］.本研究首次发现CRMP2表达水平在膀胱尿路上皮癌组织中明显比正常组织高表达.通过将CRMP2表达水平与临床病理特征进行相关性分析发现，CRMP2高表达与膀胱尿路上皮癌分级、分期、进展呈正性相关，有统计学差别，提示CRMP2在膀胱尿路上皮癌发生、进展中发挥重要的生物学作用.

CRMP2在膀胱尿路上皮癌组织中高表达，其具体机制尚需进一步探讨.有报道，CRMP2结合Tubulin异源聚合物能够促进微管组装，促进神经元生长，而CRMP2缺失能够促进非神经细胞死亡，提示CRMP2调控神经元以及非神经细胞的增殖［21-23］.Lin等［24］报道 CRMP2属于微管相关蛋白质，其碳端490-572aa介导微管结合，促进细胞有丝分裂，且这一过程能够被紫杉醇所抑制，提示膀胱尿路上皮癌中CRMP2过表达可能促进膀胱尿路上皮癌细胞加速细胞分裂和增殖，靶向抑制CRMP2有可能抑制肿瘤细胞的分裂增殖.CRMP2还是P53的负性调节因子，抑制抑癌基因P53表达，提示 CRMP2发挥促癌作用［25］.Martins等［26］通过质谱分析发现，CRMP2与Rho信号通路的多个蛋白直接结合，而Rho信号通路参与细胞骨架动力学，细胞运动和细胞增殖等细胞重要活动，提示CRMP2参与调控细胞骨架、细胞运动以及细胞增殖，促进肿瘤细胞转移和增殖.CRMP2还与细胞分裂相关蛋白直接作用，再次提供证据提示CRMP2促进细胞增殖的可能.此外，CRMP2还与细胞能量代谢蛋白如SPR、PDHX直接结合，能量代谢增强是肿瘤恶性增殖的重要环节，因此，CRMP2可能通过促进能量代谢，进而促进膀胱尿路上皮癌的恶性生物学行为［26］.综上所述，CRMP2在膀胱尿路上皮癌中高表达促进膀胱尿路上皮癌恶性生物行为的可能机制有：①作为微管相关蛋白促进微管组装，进而促进细胞增殖；②参与调控P53、Rho等肿瘤相关信号通路，调控肿瘤细胞的骨架动力学，细胞运动和细胞增殖，进而促进肿瘤侵袭转移能力；③增强肿瘤细胞能量代谢，促进肿瘤细胞增殖.

虽然本研究未能明确CRMP2促进膀胱尿路上皮癌发生发展的具体机制，但阐明了CRMP2在膀胱尿路上皮癌中的表达情况，提示CRMP2作为判定膀胱尿路上皮癌预后及个性化治疗的靶点的潜在价值.

［1］GOSHIMA Y，NAKAMURA F，STRITTMATTER P，et al.Collapsin-induced growth cone collapse mediated by an intracellular protein related to UNC-33［J］.Nature，1995，376（6540）：509-514.

［2］GAETANO C，MATSUO T，THIELE C J.Identification and characterization of a retinoic acid-regulated human homologue of the unc-33-like phosphoprotein gene（hUlip）from neuroblastoma cells［J］.The Journal of biological chemistry，1997，272（18）：12195-12201.

［3］MINTURN JE，FRYER H J，GESCHWIND D H，et al.TOAD-64，a gene expressed early in neuronal differentiation in the rat，is related to unc-33，a C.elegans gene involved in axon outgrowth［J］.The Journal of neuroscience：the official journal of the Society for Neuroscience，1995，15（10）：6757-6766.

［4］BYK T，DOBRANSK T，CIFUENTES-DIAZ C，et al.Identification and molecular characterization of Unc-33-like phosphoprotein （Ulip），a putative mammalian homolog of the axonal guidance-associated unc-33 gene product［J］.The Journal of neuroscience：the official journal of the Society for Neuroscience，1996，16（2）：688-701.

［5］SHIH J Y，YANG S C，HONG T M，et al.Collapsin response mediator protein-1 and the invasion and metastasis of cancer cells［J］.Journal of the National Cancer Institute，2001，93（18）：1392-1400.

［6］CHEN JJ，PECK K，HONG TM，et al.Global analysis of gene expression in invasion by a lung cancer model［J］.Cancer Res，2001，61（13）：5223-5230.

［7］SHIH J Y，LEE Y C，YANG S C，et al.Collapsin response mediator protein-1：a novel invasion-suppressor gene［J］.Clinical＆experimental metastasis，2003，20（1）：69-76.

［8］PAN SH，CHAO Y C，CHEN H Y，et al.Long form collapsin response mediator protein-1 （LCRMP-1）expression is associated with clinical outcome and lymph node metastasis in non-small cell lung cancer patients［J］.Lung cancer，2010，67（1）：93-100.

［9］PAN SH，CHAO Y C，HUNG PF，et al.The ability of LCRMP-1 to promote cancer invasion by enhancing filopodia formation is antagonized by CRMP-1［J］.The Journal of clinical investigation，2011，121（8）：3189-3205.

［10］WU CC，CHEN H C，CHEN SJ，et al.Identification of collapsin response mediator protein-2 as a potential marker of colorectal carcinoma by comparative analysis of cancer cell secretomes［J］.Proteomics，2008，8（2）：316-332.

［11］SHIMADA K，ISHIKAWA T，NAKAMURA F，et al.Collapsin response mediator protein 2 is involved in regulating breast cancer progression［J］.Breast cancer，2014，21（6）：715-723.

［12］HONNORAT J，BYK T，KUSTERS I，et al.Ulip/CRMP proteins are recognized by autoantibodies in paraneoplastic neurological syndromes［J］.The European journal of neuroscience，1999，11（12）：4226-4232.

［13］TRYBUS T M，BURGRESS A C，WOJON K J，et al.Distinct areas of allelic loss on chromosomal regions 10p and 10q in human prostate cancer［J］.Cancer Res，1996，56（10）：2263-2267.

［14］PEIFFER S L，HERZOG T J，TRIBUNE D J，et al.Allelic loss of sequences from the long arm of chromosome 10 and replication errors in endometrial cancers［J］.Cancer Res，1995，55（9）：1922-1926.

［15］GAO X，PANG J，LI LY，et al.Expression profiling identifies new function of collapsin response mediator protein 4 as a metastasis-suppressor in prostate cancer［J］.Oncogene，2010，29（32）：4555-4566.

［16］LI K，PANG J，CHENG H，et al.Manipulation of prostate cancer metastasis by locus-specific modification of the CRMP4 promoter region using chimeric TALEDNA methyltransferase and demethylase［J］. Oncotarget，2015，6（12）：10030-10044.

［17］HIROSHIMA Y，NAKAMURA F，MIYAMOTO H，et al.Collapsin response mediator protein 4 expression is associated with liver metastasis and poor survival in pancreatic cancer［J］.Ann Surg Oncol，2013，20（Suppl 3）：S369-378.

［18］MEYRONET D，MASSOMA P，THIVOLET F，et al.Extensive expression of collapsin response mediator protein 5（CRMP5）is a specific marker of high-grade lung neuroendocrine carcinoma［J］. The American journal of surgical pathology，2008，32（11）：1699-1708.

［19］LIANG Y， DIEHN M， WATSON N， et al. Gene expression profiling reveals molecularly and clinically distinct subtypes of glioblastoma multiforme［J］.Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，2005，102（16）：5814-5819.

［20］YOSHIMURA T，KAWANO Y，ARIMURA N，et al.GSK-3beta regulates phosphorylation of CRMP-2 and neuronal polarity［J］.Cell，2005，120（1）：137-149.

［21］ARIMURA N，MENAGER C，KAWANO Y，et al.Phosphorylation by Rho kinase regulates CRMP-2 activity in growth cones［J］.Molecular and cellular biology，2005，25（22）：9973-9984.

［22］FUKATA Y，ITOH T J，KIMURA T，et al.CRMP-2 binds to tubulin heterodimers to promote microtubule assembly［J］.Nature cell biology，2002，4（8）：583-591.

［23］TAHIMIA C G，TOMIMATU N，NISHIGAKIR，et al.Evidence for a role of Collapsin response mediator protein-2 in signaling pathways that regulate the proliferation of non-neuronal cells［J］.Biochem Biophys Res Commun，2006，340（4）：1244-1250.

［24］LIN P C，CHAN P M，HALL C，et al.Collapsin responsemediator proteins（CRMPs）are a new class of microtubule-associated protein（MAP）that selectively interacts with as sembledmicrotubules via a taxol-sensitive binding interaction［J］. The Journal of biological chemistry，2011，286（48）：41466-41478.

［25］LLANOSS，EFEYAN A，MONSECH J，et al.A highthroughput loss-of-function screening identifies novel p53 regulators［J］.Cell cycle，2006，5（16）：1880-1885.

［26］MARTINS-DE-SOUZA D，CASSOLIJS，NASCIMENTO JM，et al.The protein interactome of collapsin response mediator protein-2 （CRMP2/DPYSL2） reveals novel partner proteins in brain tissue［J］.Proteomics Clinical applications，2015，9（9/10）：817-831.