室间质评中ALT公议靶值与参考方法测定值的比较

杨泽华,申 彬,杜怡青,胡 敏,杜建明

(山西医科大学第一医院检验科,太原 030001)

室间质量评价(external qualitative assessment,EQA)是多家实验室分析同一个标本并由外部独立机构收集和反馈实验室上报结果评价实验室操作的规程[1],其目的是评价实验室测定结果的准确性,建立起实验室间结果的可比性,是实验室检验质量的客观证据,也是实验室认可的重要依据。EQA评价结果是以参加EQA活动的实验室的测定值与靶值的偏差或离散程度为依据的,因此评价靶值的确定对室间质评至关重要,但是现行的室间质评由于评价靶值的设定问题、评价标准的问题,影响着质评结果的客观性[2]。目前靶值的一种设定方法公议靶值是从参加质评实验室得到的[3],是剔除了离群值后所有参加质评实验室测定结果的平均值。丙氨酸氨基转移酶(ALT)广泛存在于人体各种组织、器官、肌肉和骨骼中,是临床生化检验中检验次数最多的项目之一,也是常规体检的必测项目,对肝脏疾病的诊断、病情和预后判断、疗效监测等具有重要意义[4]。ALT检测现多采用全自动或半自动分析仪连同相应的检测试剂盒,不同试剂在具体组分及检测性能上存在客观差异[5],同时各医院检验部门的检测水平存在一定差距,检测结果缺乏可比性[6]。因此2002年美国临床实验室标准化委员会(IFCC)推出了丙氨酸氨基转移酶的参考方法[7],本实验室参照参考方法,并优化实验条件,建立了改良的参考系统,给临床提供具有可比性的检测数据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 仪器 SHIMADZU UV-2450紫外分光光度计、SHIMADZU-TCC比色杯恒温电子控制装置、恒温水浴箱、SHIMADZU电子天平、pH计、电子温度计、Finnpipette移液器和容量瓶、各种高精密度玻璃器皿;参加质评实验室各自的生化分析仪。

1.1.2 试剂 参考方法按照国际临床化学与检验医学联合会(IFCC)推荐的ALT参考测量程序配制试剂。还原型-β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸二钠盐(NADH)、乳酸脱氢酶(LDH)均购自Sigma公司,氯化钠(NaCl)、叠氮钠(NaN3)、氢氧化钠(NaOH)、盐酸(HCl)购自北京化工;三羟甲基氨基甲烷(Tris)、L-丙氨酸、α-酮戊二酸二钠盐、牛血清白蛋白、丙酮酸钠购自上海生工。

溶液1:称取1.60 g Tris,6.00 g L-丙氨酸,0.052 g叠氮钠,溶于约80 ml去离子水中,用1 mol/L盐酸调节溶液值至pH 7.15(37 ℃),然后置于100 ml容量瓶中,加去离子水至刻度,溶液于2-8 ℃保存,可稳定3个月。有关溶液pH值与温度的关系可参见IFCC参考测定程序中的相关附件。

溶液2:称取1.60 g Tris,0.052 g叠氮钠,溶于约80 ml去离子水中,用1 mol/L盐酸调节溶液pH值至7.15(37 ℃),然后置于100 ml容量瓶中,加去离子水至刻度。溶液于2-8 ℃保存,可稳定3个月。

溶液3:称取17.22 mg NADH,溶于2.00 ml溶液2中。2-8 ℃避光保存,稳定期为1周。试剂酶稀释液(DRE):称取1.20 g BSA,0.90 g氯化钠,溶于约80 ml去离子水中,置于100 ml容量瓶,加水至刻度。2-8 ℃保存,稳定期为1个月。

溶液4:将0.1 mol/L LDH原液用DRE稀释,使LDH的终浓度为214 kU/L(37 ℃)。

按照IFCC参考测定程序将以上溶液配制成ALT反应液R1(10 ml溶液1，0.2 ml溶液3，0.2 ml溶液4),ALT启动试剂R2:0.222 g α-酮戊二酸二钠盐,溶于6 ml水中,置于10 ml容量瓶中,加水至刻度,2-8 ℃保存,稳定期为1周。参评实验室分别使用各自生化分析仪的配套试剂检测ALT。

1.1.3 样本 2017年山西省临床检验中心发放的10个冻干样品,批号为201711,201712,201713,201714,201715,201721,201722,201723,201724,201725,分别用5 ml去离子水溶解。

1.2 方法

1.2.1 检测方法 ①参考方法参照IFCC参考测量程序建立,为不加磷酸吡哆醛方法,在参考方法正确性和精密度符合要求后,分别检测10个质评样品,每个样品检测2次,在规定的反应条件进行测定:温度37.0 ℃±0.1 ℃,波长340 nm,频带宽度≤2 nm,光路10.00 mm,孵育时间360 s,延迟时间90 s,测量间隔15 s,测定点15。依次加入样品79 μl、ALT反应液R1725 μl孵育360 s,加入ALT启动试剂R2145 μl。②参加质评各实验室按照实验室常规方法对10个样品分别进行检测,实验前按常规方法进行检测前的校准和质控,室内质控在控。

1.2.2 数据处理 ①山西省临检中心对参评实验室回报结果去除离群值后取均值作为公议靶值。②对参考方法测定值和公议靶值进行相关性和回归分析。③对参考方法测定值和公议靶值进行偏倚评估和可比性评价,以卫生部临检中心常规化学(酶学)的室间比对的允许偏倚为标准判断是否通过。

2 结果

2.1 计算ALT浓度

对吸光度数据进行回归分析,计算出单位时间内吸光度的变化,进而算出酶浓度。全部批号的第一次测定数据点结果见表1,对批号201712数据点进行回归分析,计算单位时间内的吸光度变化。依次按以上方法对其他批次进行检测计算,表1中批号201711-201715测定数据点的回归分析见图1,批号201721-201725测定数据点的回归分析见图2,全部批号的回归分析方程见表2。

对批号201712第一次检测的结果应按以下公式计算ALT浓度:

其中,K:酶活性浓度定量系数;ε:NADH在340 nm处的摩尔消光系数,为6.3×103cm2/mol;V:反应混合液的体积(ml);v:样本体积(ml);L:比色杯光径(cm)。

综上,批号201712第一次检测的ALT浓度为0.077 6×1 907=148.0(U/L)。

表1所有批号第一次测定ALT的吸光度

Table1MeasuredabsorbancesofALTforallbatchesinthefirsttime

时间(min)吸光度2017112017122017132017142017152017212017222017232017242017257.501.68781.85661.60561.69141.86042.09461.72202.03931.74491.71577.751.68061.83911.60281.68191.83582.09131.70872.03711.73311.70258.001.67321.81971.59881.67411.81232.08721.69542.03131.71951.69118.251.66721.80131.59661.66651.78482.08321.68062.02911.71081.67678.501.65811.78121.59321.65531.76002.07841.66972.02481.69641.66538.751.65021.76391.58951.64691.73462.07601.65602.02261.68451.65149.001.64121.74301.58711.63791.71012.06971.64182.01561.67221.63889.251.63291.72411.58431.62891.68292.06341.62972.01281.66151.62549.501.62571.70361.58121.62091.65812.06341.61472.00861.64961.61229.751.61641.68551.57841.61021.63152.05731.60262.00381.63621.598810.001.60781.66531.57561.60101.60642.05271.58902.00041.62481.586410.251.60011.64591.57251.59241.58092.04901.57431.99431.61111.573010.501.59161.62541.5691.58271.55482.04371.56061.99171.59851.561110.751.58401.60531.56631.57381.52922.03931.54881.98701.58641.547011.001.57661.58611.56331.56381.50482.03561.53531.98181.57451.5356

图1 批号201711-201715 ALT测定数据点回归分析Figure 1 Regression analysis of ALT in batch number 201711-201715

图2 批号201721-201725 ALT测定数据点回归分析Figure 2 Regression analysis diagram of ALT in batch number 201721-201725

表2所有批号第一次检测数据点回归分析方程

Table2RegressionanalysisequationofdeterminedvaluesofALTforallbatchesinthefirsttime

批号 回归方程201711Y=-0.0324X+1.9326201712Y=-0.0776X+2.441201713Y=-0.012X+1.6955201714Y=-0.0364X+1.9653201715Y=-0.1022X+2.628201721Y=-0.0171X+2.2242201722Y=-0.0535X+2.123201723Y=-0.0165X+2.165201724Y=-0.0487X+2.111201725Y=-0.0518X+2.1047

2.2 直线回归方程及R2

对ALT的公议靶值及参考方法测定值进行相关回归分析,得到回归方程Y=1.053 3X-1.491,R2=0.099 3,相关性良好,回归曲线见图3。

2.3 两种测定方法的偏倚评估和可接受性评价

所有批号的相对偏倚均小于卫生部临检中心规定的1/2TEa(总允许误差),公议靶值均为临床可接受(见表3)。

3 讨论

本研究发现,在散点图中,公议靶值与参考方法测定值具有良好的相关性,进而可以进行下一步检验,计算公议靶值与参考方法测定值偏倚(SE)和相对偏倚,在表3中所有批号的相对偏倚均小于卫生部临检中心规定的1/2总允许误差(TEa),均为临床可接受,但是在批号201715，201721，201724相对偏倚较大,可以发现在采用参评实验室的数据计算得到的公议靶值可能存在一定方向的偏倚,可能受到一些人为因素，如:质评数据回报真实性的问题、质评标本特殊对待的问题、仪器校准等方面的问题。这时如果采用参考方法定值作为标准,可以减少当多家实验室出现方向一致的偏倚时所导致靶值出现的偏倚,使本来测量准确的实验室可能就会不合格,在一定程度上提高正确性,使室间质量评价更科学化、合理化[8]。然而,我国临床检验参考系统的建立正处于起步阶段,鉴于现状,要完善室间质评尚需时间。现阶段,建议:对于已经建立参考方法的检测项目,尽可能使用参考方法设定靶值来进行评价;对于尚未建立参考方法的检测项目,先选用国际、区域或国家标准颁布的方法,或知名学术组织的推荐方法设定靶值进行评价。在未建立参考实验室网络的情况下,有些研究者也提出并尝试由一个地区的一家或几家实验室用参考方法定值,其他实验室向其靠拢以解决分组问题,使不同方法及分析系统的测定值有可比性[9]。但是,参考方法的建立需要耗费大量的人力、物力,大规模地应用于室间质评是很困难的,现在的公议靶值在临床可接受范围内,可以暂时考虑先作为质评靶值的方法,普及程度和实用性相对比较高,但是为了提升检验质量,规范EQA,参考方法、参考系统质评用于质评物质定值成为必然的趋势[10]。

图3 两种方法测定ALT散点图Figure 3 Scatter plot of ALT between two methods

表3参考方法和临床常规检测方法检测室间质评样本的相对偏倚

Table3Relativebiasofthevaluesbyreferencemethodandclinicalanalyticmethodinexternalqualitativeassessment

批次参考方法测定均值公议靶值相对偏倚(%)1/2TEa(%)20171161.961-1.518201712148.01544.10820171322.822-3.55820171469.5712.148201715194.02045.15820172132.6356.868201722102.01053.24820172331.4334.79820172492.9985.24820172598.31012.658

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