11β-HSD1抑制剂对大鼠股骨头坏死微环境及骨重建影响的实验研究

何 宁，曾 云，王志勇，韩 珩，唐 冰，熊 敏

0 引言

骨代谢过程中起决定作用的细胞是成骨细胞及破骨细胞，可促进骨形成和骨吸收，糖皮质激素在维持骨吸收、骨形成的平衡以及在促进骨代谢、骨骼生长等方面发挥了必不可少的作用[1-3]。然而，目前，随着糖皮质激素类药物的广泛使用，由激素所引发的股骨头坏死比较常见，后者可引起骨组织产生一系列的病理性变化，影响骨功能[4]。内源糖皮质激素的关键代谢酶是11β-羟基类固醇脱氢酶(11β-hydroxysteroid dehydrogenase，11β-HSD1)，也是糖皮质激素在组织水平上的前受体调节剂，可以催化C11 位的酮基转化为羟基，使皮质醇向11-脱皮质酮转化，生物学活性丧失[5-7]。有研究表明，在特殊状态下，局部11β-HSD1可能改变，引起糖皮质激素水平变化，骨代谢稳态受到影响[8-11]。本文探讨了11β-HSD1抑制剂对大鼠股骨头坏死微环境及骨重建的影响，分析11β-HSD1的作用机制，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 动物与试剂 上海斯莱克实验动物有限责任公司提供的清洁级SD大鼠40只，雌雄各半，体重(200±20) g，合格证号：SYXK2103-0003。悬吊动物饲养饮水瓶，使动物饮水时，下肢保持直立，喂养采用普通饲料。链霉亲和素-生物素复合物(SABC)购自武汉博士德公司；醋酸皮质酮购自Sigma公司；一抗11β-HSD1购自武汉博士德公司。

1.2 动物处理 采用抽签法随机分组，清洁级SD大鼠40只分为空白组10只和模型组30只，每次实验均精确称重，模型组建立激素诱导股骨头坏死模型。本研究参照文献[4]的造模法，模型组建立激素诱导股骨头坏死模型，于腹腔注射青霉素钠(14万U/只)和醋酸泼尼松龙(24.5 mg/kg)，2次/周，连续使用4周。空白组用生理盐水代替激素，于腹腔内注射等剂量的青霉素和生理盐水。模型组造模成功后分为对照组与实验组，各15只，对照组不进行处理，实验组选择腹腔内注射11β-HSD1抑制剂(8 g/kg)，2次/周，处理4周。

1.3 观察指标 ①11β-HSD1检测：颈椎脱臼法处死大鼠，无菌条件下摘取其双侧股骨头，制作标本，进行石蜡切片，采用兔抗大鼠多克隆一抗11β-HSD1，测定11β-HSD1在股骨头内的表达，选择β-actin作为内标，4 ℃冰箱孵育12 h，采用免疫印迹法。②TGF-β1检测：抽取实验大鼠的腹部静脉血，4 ℃ 2 000 r/min离心15 min，取上层血清，采用酶联免疫法测定血清TGF-β1含量。③SOD与MDA检测：实验后将10%水合氯醛350 mg/kg注射于腹腔，将大鼠颈椎脱臼法处死后，进行SOD与MDA的检测，检测区域为脑组织海马区。

2 结果

2.1 11β-HSD1表达情况对比 模型组的11β-HSD1相对表达量明显高于空白组(P<0.05)，实验组的11β-HSD1相对表达量低于对照组(P<0.05)。见表1、图1。

表1 不同大鼠的11β-HSD1表达情况比较

2.2 血清TGF-β1含量对比 模型组的血清 TGF-β1含量为(51.44±6.39) pg/mL，空白组为(29.44±4.29) pg/mL，试验组为(48.29±5.11) pg/mL，对照组为(59.22±5.11) pg/mL，差异有统计学意义(P<0.05)。见表2。

图1 各组大鼠11β-HSD1表达情况对比

表2 不同大鼠的血清 TGF-β1含量表达情况比较

2.3 SOD与MDA含量对比 与空白组相比，模型组SOD含量减少(P<0.05)，MDA显著增加(P<0.05)；实验组的SOD与MDA含量与对照组比较差异有统计学意义(P<0.05)。见表3。

表3 不同大鼠的脑组织SOD、MDA含量比较

3 讨论

骨重建过程是一个新骨替换旧骨的过程，伴随着骨吸收与骨形成过程相偶联。骨形成过程中，成骨细胞在骨基质的矿化、合成及分泌中起主要作用，为主要的功能细胞[12]；对糖皮质激素较为敏感[13]，正常剂量下功能维持，高剂量下不耐受，会引发骨小梁密度减少等情况的发生，延缓骨重建进程，诱导股骨头坏死的发生[14]。股骨头微环境内存在多种细胞成分，包括成骨细胞、骨髓间质细胞、脂肪细胞等。

现代研究表明，骨组织内的11β-HSD1与糖皮质激素所引发的骨代谢异常紧密相关。11β-HSD1属于短肽链乙醇氧化还原酶家族，定位于1号染色体上，含有2个糖基化位点，6个外显子。糖基化抑制剂对11β-HSD1的脱氢酶起到抑制作用[15]。有研究发现，地塞米松诱导人前成骨细胞株，11β-HSD1的活动随地塞米松剂量加大而逐渐下降，在IL-1β、TNF-α等炎症因子协同下，可导致11β-HSD1的表达增多，骨代谢异常及股骨头坏死发生的可能性增加[16]；细胞碱性磷酸酶的矿化活动随地塞米松剂量加大而逐渐增多，具有平台期[17]。本研究显示，模型组的11β-HSD1相对表达量明显高于空白组，实验组的11β-HSD1相对表达量低于于对照组。也有研究显示，健康男性的外周血骨钙蛋白、N-末端Ⅰ型胶原前肽等骨形成标志物，在摄入过量的泼尼松后出现下降趋势，下降程度与体内11β-HSD1活动相关[18]。骨重建过程与成骨细胞分化的功能状态、不同的阶段、细胞数量等具有相关性。

11β-HSD1在成骨与脂肪细胞均有中等量表达，能影响细胞局部内源性糖皮质激素的二次激活。而在股骨头微环境中，随着成骨及脂肪细胞外部内源性糖皮质激素水平的下降，11β-HSD1的表达反而增强[19]。有报道，当糖皮质激素过量，11β-HSD1与糖皮质激素的关系呈现正相关，延长皮质醇的活性半衰期，增强激素对组织或成骨细胞的效应，影响微环境内骨小梁发育及生理状态[20]。TGF-β1在血小板和骨组织中含量丰富，是一种具有多种功能的多肽，可以促血管生长，与各类软组织的损伤修复相关，起促进作用。TGF-β1在骨与软骨的形成、炎症反应以及组织修复过程中也起到重要作用。本研究显示，11β-HSD1抑制剂对11β-HSD1表达的调节，有利于激素性股骨头缺血坏死大鼠股骨头的重建。也有研究表明，随着人类年龄增长，IGF-1β等生长因子含量减少，而11β-HSD1在骨组织中的表达增加，导致骨组织含水量减少，骨的弹性减弱，抗压能力降低[21]。

正常机体氧自由基产生与清除处于动态平衡，但是由于多因素的影响，机体氧自由基平衡失调，生成增加，而清除减少，过多的活性氧对DNA、酶类以及生物膜类等产生破坏作用，引发细胞死亡，损伤脑组织，产生破坏作用[22]。脂质过氧化的主要终产物是MDA，机体内MDA水平可间接反映脂质过氧化的程度以及氧自由基水平。SOD经歧化反应，使氧自由基减少，从而使细胞损害减少。本研究结果显示，与空白组相比，模型组SOD含量减少，MDA含量显著增加；实验组的SOD与MDA含量与对照组相比差异有统计学意义，表明11β-HSD1抑制剂清理自由基和抗氧化作用更强。有研究表明，11β-HSD1转基因小鼠经激素处理后，其成骨细胞、骨形成率、骨质面积与经激素处理的普通实验大鼠相比，明显增高，说明早期前分化细胞的排列及成熟过程受11β-HSD1影响，表达过多会出现一定的干扰[23]。

总之，11β-HSD1抑制剂能够改善大鼠股骨头坏死的微环境，抑制TGF-β1的表达，增强成骨作用，有利于骨重建。

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