近红外光谱法用于半夏伪品鉴别

夏爱萍

0 引言

半夏为天南星科半夏属半夏Pinelliaternata(Thunb.)Breit.，又名地文、守田等，药用部位为圆球形块茎，具有燥湿化痰、降逆止呕、消痞散结的功效[1]，为临床常用中药之一。有研究报道，半夏中所含的活性物质基础包括生物碱、氨基酸、挥发油、有机酸、核苷等[2-4]。作为一种常用药，半夏的临床需求量大，但受限于产量低、野生资源匮乏及人工种植品的质量难以保证等限制，半夏的产量很难满足临床用量的需求[5]。因此，某些不法分子常会用与半夏同属而不同种但产量高、价格低廉的掌叶半夏，甚至同科不同属的水半夏、天南星冒充半夏使用[6-9]，极大地影响了临床药效和用药安全。有学者利用HPLC法同时测定了多种来源半夏及其伪品中9种核苷类活性成分的含量，发现半夏中部分核苷类成分的含量与水半夏、天南星存在显著差别[10]，因此可用HPLC法鉴别出上述2种伪品；但掌叶半夏与半夏中上述9种核苷类成分的含量无明显差别，因此不能达到鉴别的目的。

本实验采用近红外光谱法，建立判别模型，对半夏和掌叶半夏进行了判别分析和聚类分析，成功对两者进行了判别。

1 仪器及试药

MPA-TM近红外光谱仪(检测器为InGaSe)，德国布鲁克光学仪器公司。半夏样品(共23批样品)和掌叶半夏样品(共12批样品)均购自浙江中医药大学中药饮片有限公司，并经朱涛副主任中药师进行生药学鉴定。

2 方法与结果

2.1 光谱采集 使用MPA-TM型近红外光谱仪的漫反射组件，检测器：InGaSe，数据分析软件：DPS 7.55/OPUS/TQ Analyst。扫描波长范围为10 000～4 000 cm-1，扫描次数为32次，分辨率为8 cm-1。半夏样品和掌叶半夏样品分别粉碎成粗粉(过20目筛)，取适量药材粗粉，均匀地铺满样品杯(50 mm×50 mm)杯底，每份样品重复扫描3次，计算平均光谱，如图1所示。

图1 半夏和掌叶半夏近红外光谱图

2.2 判别分析 判别分析指利用样品红外光谱自身所具备的特征值作为依据，以判别其所归属的不同类型，是一种基于多变量统计的分类方法。在对不同样品的红外光谱进行预处理之后，选择最具代表性和最具区分力的红外光谱特征波段，以不同种类样本间的马氏距离作为判定依据，建立判别模型，之后采用未知样品的红外光谱数据与已有的判别模型进行拟合，得出未知样品与校正集之间的马氏距离，以此为依据进行辨别和归属[11]。

2.3 聚类分析 首先将每1个样本都归为1个单独的类别，然后以在多维空间中的距离为判定依据，挑选出最为相似的一对样本合并成1个新的类别，再计算新类别与其他所有类别的相似情况，选取其中最为相似的2个类别合并成1个新的类别，这样就能每次减少1个类别，直到所有的样本都归为1个类别，从而达到分类的目的。不同样本红外光谱之间的距离表明对应样本的相似度，两张光谱之间的距离值随着样本差别的减小而减小、随着样本差别的增大而增大，相似样本的红外光谱以组的形式进行分类，再将组的形式以树状图的方式表示[12]。

3 结果与分析

3.1 判别分析

3.1.1 预处理方法对判别结果的作用 在建立半夏判别模型之前，应先对原始图谱进行预处理，以去除因为仪器误差所引起的红外光谱偏移或基线的漂移，提高半夏及掌叶半夏近红外光谱数据和样品性质两者间的相关性[13]。目前对原始光谱的预处理方法主要有一阶导数法、二阶导数法、MSC、SNV等。光谱预处理结果见表1。

表1 不同光谱预处理对校正模型辨识结果的影响

由表1可知，选择不同的波段和预处理方法，对判别结果-辨识率的影响非常显著。建立模型之前，应先对波段进行筛选，既能去除某些波段噪音的影响，又能提高工作站的运算速度；MSC方法能够消除因样本的镜面反射及不均匀性所产生的噪音；SNV方法是将红外光谱数据进行归一化运算处理后，有效去除了采集光谱时由于样品散射效应所产生的噪音；导数法能够显著地去除基线漂移，并能通过对特征峰的锐化，显著强化谱带的特征，但其也会将部分噪音强化，降噪音放大，降低谱带的信噪比[14]。因此，在6 600～5 400 cm-1波段，原始光谱结合MSC/SNV预处理方法的效果均非常理想，显著优于原始光谱及其他预处理方法，校正集的辨识率能够达到100%，两组模型判别结果非常理想。采用原始光谱结合MSC/SNV的预处理方法均适用于半夏及其伪品掌叶半夏的判别分析。

3.1.2 模型的建立 按“3.1.1”项下方法，对全部35个校正集样本采用原始光谱结合MSC/SNV的预处理方式，结合选定波段为6 600～5 400 cm-1，建立半夏与掌叶半夏近红外光谱判别分析模型，见图2。由图2可知，在半夏样品区域和掌叶半夏样品区域内，均无被错判样本存在，对所有样本的辨识率达100%。表明采用MSC或SNV方法对原始光谱进行预处理，均能够较好地判别出半夏与掌叶半夏，实现半夏与其伪品掌叶半夏的鉴别。

3.1.3 模型验证分析 用上述两组红外光谱判别模型对预测集的6个样本分别进行判别分析，相应的分析结果见表2。

图2 半夏样品判别分析结果

表2 6个验证样品判别预测分析结果

由表2可知，所有6个预测集样本中均未出现错误辨识，辨识的正确率为100%，说明在波段6 600～5 400 cm-1范围内，采用MSC或SNV预处理，能很好地判别半夏的真伪，可建立半夏的近红外指纹图谱。

3.2 聚类分析 将半夏及掌叶半夏样品原始光谱的波长及该波长的吸光度进行拟合，得到新的红外数据，再使用DPS 7.55软件中的聚类分析模块对新的红外数据进行处理，最终得到聚类分析的树状图，见图3。

图3 半夏及掌叶半夏聚类分析结果

由图3可知，以距离系数560为判定距离进行划分，将半夏样品归成一类，掌叶半夏样品归成另一类。其中，有1个半夏样本发生了误判。误判样本为21号半夏，其产地为河南渑池，造成误判的原因暂不明确，还需进一步研究。半夏样品近红外光谱聚类分析判定结果的准确率为96.9%，聚类分析的判定结果较好，基本能够达到鉴别所需，证明利用聚类分析的方法对半夏及其伪品掌叶半夏的鉴别是可行的。

4 讨论

HPLC法涉及供试品中活性成分的提取、富集等，由于提取条件等因素所限，无法将药材中所有的活性成分提取出来；同时，已存在于供试液中的活性成分也无法全部体现在图谱中。因此，采用HPLC法仅能分辨出与半夏差别较大的伪品-水半夏及天南星[10]，而对与半夏差别不大的掌叶半夏，则无法达到区分的目的。

近红外光谱法是一种全成分分析法，可有效体现出药材中全部活性成分的变化，因此在分辨一些差别较小的样品时，具有很大的优势。近红外光谱法结合强大的数据处理技术，在中药材的鉴别方面具有快速、客观、无损等优势，作为中药材鉴别的一种新手段，具有广阔的应用前景。但上述优势是建立在相关的识别模型可靠的基础之上，建立上述模型需要选取不同来源的、具有代表性的样品建立模型，尽可能地扩大样本量，并结合相应技术，剔除掉异常样本，以提高模型的准确性和可靠性，否则容易出现误判的现象。

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