PI3Kγ抑制剂AS605240与5-氟尿嘧啶联合应用对小鼠乳腺癌细胞增殖及转移的影响

金 科，朱剑梅，邱发麒

0 引言

乳腺癌是指起源于乳腺导管内上皮或乳腺小叶的恶性肿瘤，是全球女性最常见的恶性肿瘤，在我国，其发生率在女性恶性肿瘤中居首位，其死亡率排在第6位[1-2]。国际癌症研究中心(International Agency for Research on Cancer，IARC)报道，2012年全球乳腺癌新发病例超过120万，标化发病率为37.68/100 000，标化死亡率为13.51/100 000；我国每年新增约 21 万乳腺癌患者，略高于发达国家(1%～2%)，而我国乳腺癌标化发病率以及标化死亡率约为16.36/100 000和4.51/100 000，为全球最低[3-5]。近年来，我国乳腺癌发病率逐年上升，上海、北京、天津及沿海地区为高发区，流行趋势明显改变为城市高于农村，沿海地区高于内地。乳腺癌严重影响了患者的生活及生存质量，因此，对乳腺癌发病机制及治疗药物的研究尤为重要[6]。磷酸肌醇3-激酶γ (Phosphatidylinositide 3-kinaseγ，PI3Kγ)是Ras基因调控的下游靶位点，其在癌症的发生、发展、转移过程中发挥着重要的调控作用[7]。有报道，Ras通过一系列级联反应，磷酸化PI3Kγ，后者可直接参与肿瘤细胞的增殖、血管生成、侵袭转移。作为一种高选择性的PI3Kγ抑制剂，AS605240能明显抑制肿瘤细胞的生长，且其在细胞凋亡、慢性炎症、血管生成过程中均发挥重要作用。5-氟尿嘧啶为常规的乳腺癌化疗药物[8-9]。Ki-67、cyc D1、β-catenin蛋白是调节肿瘤细胞周期、参与肿瘤增殖的重要细胞因子，而VEGF、p53蛋白与肿瘤转移密切相关[10]。因此，本研究拟以PI3Kγ抑制剂AS605240与5-氟尿嘧啶联合作用于小鼠乳腺癌细胞，分析细胞因子的改变，探讨其对小鼠乳腺癌细胞增殖及转移的影响，为乳腺癌的临床治疗提供理论和实践依据。

1 材料与方法

1.1 细胞来源、仪器与试剂 小鼠乳腺癌细胞株4T1(中国科学院典型培养物保藏中心昆明细胞库)、DnJ-4249 CO2培养箱(美国 REVCO公司)、DMEM 培养基(赛默飞世尔科技中国有限公司)、胰酶(美国 Gibco公司)、四甲基偶氮唑蓝(北京广源恒信科技发展有限公司)、胎牛血清(武汉普诺赛生命科技有限公司)、Ki-67蛋白、cyc D1蛋白、β-catenin蛋白ELISA试剂盒(上海伯豪生物技术有限公司)，VEGF蛋白、p53蛋白、CD31蛋白ELISA试剂盒(碧云天生物技术公司)、DMI3000 B倒置显微镜(德国 LEICA公司)、MK3酶标仪(美国 Thermo公司)、恒温培养箱grp-9080(美国通用公司)、二氧化碳培养箱(赛默飞世尔科技中国有限公司)、超净工作台(上海恒跃医疗器械有限公司)。

1.2 细胞复苏培养及其分组设计 小鼠乳腺癌细胞株4T1培养方法：将装有小鼠乳腺癌细胞株4T1细胞株的冻存管从液氮中取出，37 ℃水浴箱迅速解冻，无菌吸管吸取菌液至5 mL EPP无菌管中，1 500 r/min离心5 min，上清液吸弃，加入pH值为7.2的含10%胎牛血清、链霉素100 μg/mL、青霉素100 μg/mL的RPMI-1640培养基，直至5 mL，37 ℃、5% CO2培养箱中进行培养，3 d换液，当细胞融合率达到80%时，用0.5%胰蛋白酶消化传代。对照组：取10 mL小鼠乳腺癌细胞株4T1细胞液(细胞浓度为5×106/mL)于10%胎牛血清的DMEM培养液中，置于CO2培养箱(37 ℃、5% CO2、20% O2)；5-氟尿嘧啶组、PI3Kγ抑制剂组、联合组的培养方法同对照组，其10%胎牛血清DMEM培养液分别含有10 μg/mL的5-氟尿嘧啶、10 μmol/mL的PI3Kγ抑制剂AS605240，以及10 μg/mL 5-氟尿嘧啶+10 μmol/mL PI3Kγ抑制剂AS605240。

1.3 小鼠乳腺癌细胞株4T1细胞活力的MTT法检测 染毒结束后，每孔加MTT溶液(5 mg/mL) 10 μL，37 ℃孵育4 h，每孔加入150 μL的OMSO，采用酶标仪于490 nm处波长测定吸光度(A)值。

1.4 小鼠乳腺癌细胞株4T1细胞Ki-67、cycD1、β-catenin、VEGF、p53、CD31蛋白水平测定 染毒结束后，5 000 r/min 离心收集细胞，加入PBS制成细胞悬液后，酶联免疫吸附法测定培养液中Ki-67、cyc D1、β-catenin、VEGF、p53、CD31蛋白水平。

2 结果

2.1 各组乳腺癌细胞存活情况比较 5-氟尿嘧啶组、PI3Kγ抑制剂组、联合组的OD值、存活率(%)均低于对照组(t=11.86、9.40、10.23、9.98、12.56、13.33，P<0.05)；联合组的OD值、存活率(%)低于5-氟尿嘧啶组、PI3Kγ抑制剂组，差异有统计学意义(t=13.44、10.37、14.12、12.09，P<0.05)；5-氟尿嘧啶组的OD值、存活率与PI3Kγ抑制剂组相近，差异无统计学意义(t=1.13、0.98，P>0.05)，见表1。

表1 各组乳腺癌细胞存活情况比较

2.2 各组乳腺癌细胞增殖情况比较 5-氟尿嘧啶组、PI3Kγ抑制剂组、联合组的Ki-67、cyc D1、β-catenin蛋白水平均低于对照组(t=16.45、19.68、15.29、16.67、18.77、17.56、17.54、18.78、17.99，P<0.05)；联合组Ki-67、cyc D1、β-catenin蛋白水平低于5-氟尿嘧啶组、PI3Kγ抑制剂组(t=18.45、17.88、19.36、16.90、18.06、17.08，P<0.05)；5-氟尿嘧啶组Ki-67、cyc D1、β-catenin与PI3Kγ抑制剂组相近，差异无统计学意义(t=2.13、2.65、0.65，P>0.05)，见表2。

2.3 各组乳腺癌细胞转移情况比较 5-氟尿嘧啶组、PI3Kγ抑制剂组、联合组的VEGF蛋白水平低于对照组，p53蛋白水平高于对照组(t=17.67、19.65、18.26、19.28、19.24、16.90，P<0.05)；联合组VEGF蛋白水平低于5-氟尿嘧啶组、PI3Kγ抑制剂组，p53蛋白水平高于5-氟尿嘧啶组、PI3Kγ抑制剂组(t=19.24、21.79、18.37、19.49，P<0.05)；5-氟尿嘧啶组VEGF、P53与PI3Kγ抑制剂组相近，差异无统计学意义(t=2.76、2.59，P>0.05)，见表3。

表2 各组乳腺癌细胞增殖情况比较(μmol/L)

表3 各组乳腺癌细胞转移情况比较(μmol/L)

3 讨论

作为代表细胞增殖水平的细胞核的标记物，位于10q25的Ki-67基因及其所编码的蛋白被认为与细胞有丝分裂密切相关[11]。在细胞分裂中，Ki-67于G1后期出现，在S、G2期逐渐升高，并于M期达到顶峰值。Ki-67精确调控恶性肿瘤的增殖、发展、转移，是细胞增殖、完成细胞周期不可或缺的，也是检测肿瘤细胞增殖活性的重要指标之一。

cyc D1是明确的原癌基因，也是细胞周期素蛋白家族的重要组成成员，其通过作用于G1期，促进G1向S期正向转换，并以细胞周期素核编码区与CDK4/6结合，形成cyc D1-CDK4或cyc D1-CDK6复合物，此复合物是调节细胞增殖周期的关键蛋白[12]。国内外研究表明，在肿瘤的增殖、发生过程中，cyc D1基因均高度异常表达，而对鳞癌和腺癌中cyc D1基因结构进行分析，均有染色体重排、基因拷贝数增加及基因多态性的存在。

β-catenin是Wnt信号途径的重要核心信号分子，在正常细胞中，细胞质内β-catenin水平很低，不足以激活信号通路中的相关细胞因子，当细胞癌变时，细胞外的Wnt分子与癌前激活物结合，β-catenin在胞质中积累和向核内转移成为经典Wnt信号途径激活的重要标志，当Wnt 通路被激活后，细胞随即恶性增殖[13-14]。此外，PI3K通路中的3-磷酸肌醇激酶也可以磷酸化β-catenin，形成β-catenin/APC复合体，促进肿瘤细胞的进展[15]。

本研究结果表明，PI3Kγ抑制剂、5-氟尿嘧啶能明显抑制乳腺癌细胞的增殖，其机制可能与细胞周期的调控及Wnt-β-catenin信号通路的抑制有关。

VEGF是血管发生和祖内皮细胞分化的关键调节剂，也是血管内皮细胞作用唯一特异的有丝分裂原，促进其增殖，抑制其凋亡[16-17]。在肿瘤的发展过程中，VEGF与酪氨酸受体相互作用，启动信号级联反应，导致受体二聚化和自身磷酸化，激活大量下游蛋白，如3-磷酸肌醇激酶。大量研究表明，VEGF与肿瘤的增殖、侵袭和转移呈正相关[18]。p53基因为明确的抑癌基因，p53可诱导细胞停滞于G1期，促进细胞凋亡，调节细胞的分化与衰老，抑制肿瘤血管增生等，此外，p53与肿瘤细胞的浸润转移密切相关[19-20]。本研究结果表明，PI3Kγ抑制剂、5-氟尿嘧啶能明显抑制乳腺癌细胞的转移，其机制可能与VEGF的抑制与p53的促进表达有关。此外，本研究发现，PI3Kγ抑制剂AS605240与5-氟尿嘧啶联合应用时，对小鼠乳腺癌细胞增殖和转移的抑制性更好。

综上所述，PI3Kγ抑制剂AS605240与5-氟尿嘧啶联合作用，能明显抑制小鼠乳腺癌细胞增殖和转移，其机制可能与细胞周期、p53蛋白的调控以及Wnt-β-catenin信号通路、VEGF的抑制有关。

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