甲硫哒嗪对髓母细胞瘤DAOY细胞抑制作用研究

邢 丹，赵颖梅*，刘志辉，张芳菲,李克冉

0 引言

婴幼儿肿瘤中，脑部肿瘤的发病率仅次于白血病。近年来，使小儿脑肿瘤的治愈率有所提高，但除了髓母细胞瘤，其他脑肿瘤的治疗结局并没有太大改善[1]。阻碍小儿脑瘤治疗进步的主要原因是缺乏对于脑瘤发病分子机制的了解以及有效的临床靶向药物的使用。

髓母细胞瘤(Medulloblastoma)是儿童脑瘤中发病率最高的原发于小脑的恶性神经系统肿瘤，可以发生在婴儿、青少年和成人时期，根据基因表达类型分为4个亚组：wingless (WNT)组、sonic hedgehog (SHH)组、组3和组4。其中WNT组和SHH组分别是以患者WNT和SHH信号通路的不正常活化为特征[2]，而组3和组4命名是由于缺少明确的信号通路。目前，除了WNT类髓母细胞瘤和小于4周岁的儿童SHH髓母细胞瘤患儿有较好的预后，其他大部分患儿通常预后极差[3-4]。目前，我们仍然缺乏提高无瘤生存期和总体生存期的针对恶性髓母细胞瘤的有效的化疗药物。

甲硫哒嗪(Thioridazine，THIO)作为吩噻嗪(Phenothiazine)的派生物，是一种被广泛应用于精神分裂症等精神类疾病的有效的安定剂。近年研究表明，THIO对胃癌、子宫颈癌、乳腺癌、成神经细胞癌、卵巢癌等多种肿瘤具有抑制增殖和促进凋亡的作用[5-6]。进一步的研究表明，甲硫哒嗪在卵巢癌中具有抑制PI3K/AKT信号通路，下调Cyclin D1并上调细胞增殖抑制因子p21的作用[7]。而且THIO还具有对白血病肿瘤干细胞特性细胞的专一抑制性，而对正常血细胞没有抑制作用[8]。本研究利用人髓母细胞瘤细胞株DAOY，考查THIO对人髓母细胞瘤的抑制及其机制；在细胞水平检测最佳给药剂量并检测THIO对于肿瘤细胞转移和肿瘤干细胞特性的影响，为临床应用THIO治疗髓母细胞瘤提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 细胞和甲硫哒嗪 人类正常肝细胞系L02、小鼠3T3细胞株和人髓母细胞瘤细胞株DAOY均购自中科院上海生命科学院细胞库。所有细胞常规采用高糖DMEM加10%胎牛血清(购自Gibico公司)。甲硫哒嗪(THIO，>99%，批号：Y0000704)和DMSO(批号：D2650)购自Sigma-Aldrich公司。THIO先用DMSO溶解配成100 mmol/L的存储液，使用时再用DMSO配成相对应1 000×的工作液。

1.2 细胞活力检测 采用CCK8(南京凯基公司，批号：KGA317)检测细胞活力以反映生存的细胞数量。将正生长在透明96孔板的细胞更换为含有10% CCK8的完全培养基，37 ℃孵育1～4 h，使用酶标仪检测450 nm吸光度数值，减去空白对照数值，得到与细胞数呈正比的数值。

1.3 细胞周期和凋亡检测 将DAOY细胞先按照3×105/孔的密度接种到6孔板中，加入一定浓度的THIO孵育相对应时间后，收集细胞，使用PBS洗涤细胞2次后，重悬并加入5 mmol/L的NP-40和1 mg/mL的RNA酶A 37 ℃孵育1 h。使用propidium iodide (PI，>94%，批号：P4170，购自Sigma-Aldrich)染色细胞15 min后，流式FACS MoFlo XDP (Beckman Coulter)分析细胞周期。使用Annexin-V/PI(Annexin-V购自Sigma-Aldrich，批号：A9210)双染色细胞15 min，流式FACS MoFlo XDP (Beckman Coulter)分析细胞凋亡，Annexin-V和PI染色双阳性细胞为发生凋亡细胞。

1.4 细胞迁移实验和细胞自我更新实验 将在THIO处理24 h DAOY细胞和对照DAOY细胞采用无血清DMEM重悬后，以1×105/孔的密度加到Transwell(Corning Incorporated Costar，批号：3422)的滤网杯内，在杯外加入500 μL含10%胚牛血清的DMEM。细胞培养箱中培养24 h，取出小杯子，4%多聚甲醛中固定20 min后0.1%结晶紫中染色15 min，用棉棒擦去小杯子内部的细胞后，显微镜下拍照穿过膜的细胞。

细胞自我更新实验采用含有B27(购自Invitrogen，批号：17504-044)的DMEM/F12培养基(购自Invitrogen，批号：11320-033)，并在其中加入胰岛素 (4 μg/mL，购自Sigma-Aldrich，批号：I0516)、EGF (20 ng/mL，购自Sigma，批号：E4269)和bFGF (10 ng/mL，购自Life Technologie，批号：13256-029)。将细胞使用以上培养基重悬后，种入低黏附6孔板内，对照组加入2 μL DMSO，实验组加入相应浓度的THIO，细胞培养箱中培养7～10 d后，对细胞进行计数和拍照。

1.5 RNA提取和定量PCR 采用TRIzol solution(Life Technologies，批号：15596-026)裂解细胞并提取细胞内RNA，使用逆转录试剂盒(PrimeScriptTMⅡ 1st Strand cDNA Synthesis Kit,大连宝生物，批号：6210A)反转录成cDNA。对相应基因表达设计引物，见表1，利用SYBR®Fast qPCR Mix (大连宝生物，批号：RR430S)进行定量PCR。

2 结果

2.1 不同浓度THIO对髓母细胞瘤细胞株DAOY的增殖抑制作用 利用CCK8考察不同浓度梯度的THIO对人髓母细胞瘤细胞株DAOY的抑制作用。将正常人永生化肝细胞L02和小鼠3T3细胞株作为正常细胞对照。THIO对于髓母细胞瘤细胞株DAOY的抑制是浓度依赖的，10 μmol/L和50 μmol/L都对DAOY有较强的增殖抑制作用，而1 μmol/L的浓度基本没有抑制作用，见图1。同时，为了考察THIO作为临床治疗肿瘤药物的可能性，我们检测了不同浓度THIO 对于人类正常细胞株的毒副作用。可以看到10 μmol/L的THIO对于L02和小鼠细胞株3T3的增殖影响较小，而50 μmol/L都具有较强的抑制作用，见图2、图3。为进一步考察THIO对DAOY细胞增殖的抑制作用，我们使用10 μmol/L THIO处理DAOY细胞株0～3 d后，使用流式细胞术检测细胞周期和凋亡。与没有THIO处理的对照细胞相比，THIO处理抑制细胞周期进展，减少细胞在G2/ M和S期分布并且与处理时长呈正相关，见表2。同时，与对照组相比，THIO促进DAOY凋亡并且也与处理时长呈相关，见表2。

表1 定量PCR引物序列

图1 不同浓度THIO对于DAOY细胞生长的影响

图2 不同浓度THIO对于L02细胞生长的影响

图3 不同浓度THIO对于3T3细胞生长的影响

表2 THIO处理对DAOY细胞周期和细胞凋亡的影响(n=3)

2.2 THIO对DAOY细胞转移能力和在低糖条件下生存能力的影响 THIO处理3 d后检测细胞穿膜能力，结果表明，THIO明显抑制了DAOY细胞的转移能力，见图4。肿瘤细胞的另一个特点是快速增殖，快速增殖的肿瘤细胞往往处于低糖的饥饿环境中，本研究应用葡萄糖浓度为1 g/L的低糖DMEM(LGM)作为饥饿培养基模拟肿瘤的低糖环境。将10 μmol/L THIO加入到LGM用作DAOY细胞的培养基，与对照组加入DMSO相比，THIO明显降低了DAOY细胞在LGM培养基的生存率，见图5。为进一步研究DAOY细胞生存减少的机制，本研究检测THIO处理后DAOY细胞的糖摄取能力和ATP水平。发现THIO显著降低了DAOY细胞的糖摄取能力和ATP水平，见图6、图7。

图5 THIO处理降低DAOY在低糖条件下(LGM)的生存能力

图6 THIO处理降低DAOY对葡萄糖的摄取能力

图7 THIO处理降低DAOY在低糖条件下ATP水平

2.3 THIO对DAOY细胞肿瘤干细胞特性基因表达和自我更新能力的影响 具有肿瘤干细胞特征的细胞在肿瘤发生发展过程中具有重要作用。我们检测THIO处理对于干细胞特性基因表达的影响。10 μmol/L THIO处理DAOY细胞3 d后，CD133、CD90、Oct4、Sox2和KLF4表达显著下降，而C-myc和Nanog表达也有所下降。同时，10 μmol/L THIO处理DAOY细胞也明显降低肿瘤细胞的自我更新能力，见图8、表3，显著减少肿瘤成球(Spheroid)的形成数量，并降低细胞成球的直径，见表4。

3 讨论

THIO是美国食品与药品管理局(FDA)批准的安宁类药物，在临床上广泛用于治疗精神分裂症和精神类疾病。最近的研究表明，THIO对多种肿瘤具有抗肿瘤生长和抵制肿瘤干细胞增殖的作用。THIO是多巴胺受体D2 (DRD2)抑制剂。可以调节WNT和AKT信号通路，并且可以诱导胚层细胞的凋亡[9-10]。THIO能导致DNA断裂和增加Caspase-3表达[11]。近年来，国内已有研究表明，THIO对子宫内膜癌和结肠癌具有抑癌作用[12-13]。本研究发现，THIO在合适的浓度范围内可以对髓母细胞瘤细胞DAOY起到有效的杀灭作用，而对正常细胞抑制作用较小。

图8 THIO降低DAOY细胞肿瘤自我更新能力

表3 THIO处理降低DAOY细胞自我更新能力(n=5)

恶性肿瘤中占较少比例的肿瘤干细胞(CSCs)，又称肿瘤起始细胞(TICs)，具有自我更新能力、无限增殖能力，对肿瘤的发生、发展和转移有重要作用[14]。因此，靶向CSCs对肿瘤的消除，特别是发生转移的肿瘤的治疗至关重要。本研究显示，THIO可有效降低髓母细胞瘤细胞中肿瘤干细胞特性基因的表达，因此，可能对肿瘤干细胞的增殖和自我更新有重要的抑制作用。

综上所述，10 μmol/L THIO对髓母细胞瘤细胞系DAOY的增殖能力和低糖条件下的生存能力有明显的抑制作用。此外，其对于肿瘤干细胞特性基因的表达也有明显下调的作用，为THIO用于临床治疗髓母细胞瘤提供了理论基础。

表4 THIO处理对肿瘤干细胞特性基因表达的影响(n=3)

注：与对照组(THIO 0 μmol/L)比较，*P<0.05

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