龟鹿二仙胶逆转化疗诱导的造血干细胞衰老的机制研究

王珏 陈朝辉 邵科钉 张卫平 应吟吟 林胜友

1.浙江中医药大学附属第三医院 杭州 310005 2.象山县第一人民医院 3.浙江中医药大学 4.浙江中医药大学附属广兴医院

恶性肿瘤的发病率和死亡率一直居高不下，大多数肿瘤患者在诊断时已经处于中晚期，化疗是其主要的治疗手段之一。化疗疗效确切，但90%的化疗药物都会造成骨髓抑制[1]，从而影响了化疗的顺利进行甚至影响疗效。目前认为化疗导致骨髓抑制最关键的机制是诱导造血干细胞（hematopoietic stem cell，HSC）衰老[2]。研究表明，p16Ink4a-Rb信号通路参与了细胞衰老的过程，p16Ink4a-Rb信号通路能影响正常细胞周期的进程，导致细胞周期阻滞，使细胞自我更新能力下降而发生衰老[3]。本研究团队前期研究发现，龟鹿二仙胶巴布剂可以减轻Ⅲ～Ⅳ期结直肠癌患者化疗后的骨髓抑制，改善中医症状积分，提高患者的生存质量[4]。进一步研究证实龟鹿二仙胶可以通过上调抗凋亡基因bcl-2的表达改善DNA损伤，促进骨髓HSC增殖及修复，从而抵抗化疗小鼠的骨髓抑制[5]。但有关龟鹿二仙胶对HSC的影响及其作用机制尚不清楚，为此笔者进行了进一步研究，旨在阐明其分子机制。

1 材料和方法

1.1 实验动物 8周龄SPF级雄性昆明种小鼠31只，体质量（20±2）g，购自上海斯莱克实验动物有限责任公司[许可证号：SCXK（沪）2013-0018；合格证号：02600481]。饲养于杭州赫贝科技有限公司动物中心[许可证号：SYXK（浙）2015-0008]，温度范围 20～25℃，相对湿度范围40%～70%。

1.2 药物 龟鹿二仙胶由鹿角胶、龟板、生晒参、枸杞子组成，采购于浙江中医药大学附属第三医院中药药剂科，按照2:3:3:5的比例，由浙江中医药大学中医研究院煎至生药含量为1g·mL-1的煎液，4℃冰箱保存；注射用环磷酰胺（cyclophosphamide，CTX）购于Baxter Oncology GmbH公司（批号：5L089A），有效期至2017年11月。

1.3 主要试剂 RPMI 1640培养基、DMEM培养基均购于美国 Gibco公司（批号：8117008、8117186）；衰老相关β-半乳糖苷酶（senescence associated beta-galactosidase,SA-β-gal）染色试剂盒、Western 及 IP 细胞裂解液购于碧云天生物技术公司（批号：C0602、P0018）；CCK-8试剂盒、细胞周期试剂盒购于联科生物公司（批号：76774434、5223847）；LS 柱为 Miltenyi公司产品（批号：6165901）；小鼠骨髓淋巴细胞分离液购于天津灏洋生物公司（批号：20170107）；PVDF膜购于Millipore公司（批号：K5JA5013L）；彩色预染蛋白分子量标准为Fermentas公司产品（批号：00174777）；高纯总RNA快速提取试剂盒购于Generay公司（批号：1612G08）；逆转录试剂盒HiScript-Ⅱ Q RT SuperMix for qPCR和qPCR试剂ChamQ SYBR Color qPCR MasterMix均为Vazyme公司产品（批号：7E092G6、7E092H6）；细胞周期蛋白依赖性激酶4/6（cyclin-dependent kinases4/6,CDK4/6）、pRb、β-Actin 抗体购于 Santa公司（批号：D2815、G0910、C8820）；p16 抗体为 Abcam 公司产品（批号：GR212660-23）。

1.4 主要仪器 3111型二氧化碳培养箱（美国Thermo公司）；IX73型荧光显微镜（日本Olympus公司）；quadro MACS型分选器（德国Miltenyi公司）；Spectra－Max Plus 384型全波长酶标仪（美国Molecular Devices公司）；Mini-Proten Tetra System电泳系统（美国Bio-RAD公司）；ChemiDoc XRS+System凝胶成像仪（美国Bio-RAD公司）；定量PCR仪（美国Bio-RAD公司）。

1.5 方法

1.5.1 细胞培养 肝癌细胞株H22购自武汉大学细胞库，采用含有10%FBS的RPMI 1640培养基，在37℃、5%CO2、饱和湿度条件下传代培养。

1.5.2 荷瘤小鼠模型制备 根据前期实验方法制备荷瘤小鼠模型[5]。取正常传代的H22细胞，用无菌DHanks液稀释成细胞浓度为1.0×107个/mL的细胞悬液。选择1只健康小鼠，将H22细胞悬液接种于小鼠腹腔内，接种体积0.1mL。待腹水生成后抽取腹水，调整细胞浓度为1.0×107个/mL，接种于其余30只小鼠右侧腋部皮下，接种体积0.1mL。接种后第3天接种小鼠长出肉眼可见的肿瘤结节，证明荷瘤小鼠模型建模成功，成瘤率100%。

1.5.3 分组及给药方式 将30只荷瘤小鼠随机分成3组，即对照组、模型组、龟鹿二仙胶组，每组10只。对照组予0.9%氯化钠溶液0.2mL腹腔注射，1次/d，连续3d（d1～3），同时予0.9%氯化钠溶液0.3mL灌胃，1次/d，连续9d（d1～9）。模型组根据前期实验，予CTX 100mg/（kg·d）腹腔注射，1次/d，连续3d（d1～3），同时予0.9%氯化钠溶液0.3mL灌胃，1次/d，连续9d（d1～9）。龟鹿二仙胶组予CTX 100mg/（kg·d）腹腔注射，1次/d，连续 3d（d1～3），同时予龟鹿二仙胶 9.5g/（kg·d）灌胃，1 次/d，连续 9d（d1～9）。龟鹿二仙胶剂量按照70kg成人每日用量（鹿角胶6g，龟板6g，生晒参9g，枸杞子15g），同时参考人和动物间体表面积折算的等效剂量比值表[6]换算得出。20g左右小鼠的灌胃剂量约为0.19g/d。前期实验以此剂量为中剂量组，加大一倍剂量为高剂量组，减少一半为低剂量组[5]。预实验连续用药9d，证实中剂量疗效最好，故最终确定为此剂量。

1.5.4 骨髓HSC分选

1.5.4.1 骨髓细胞分离 停药24h后于d10处死小鼠，无菌分离双侧胫腓骨，PBS漂洗2遍，1mL注射器吹打，获取全骨髓细胞悬液，1 000r/min离心10min，收集细胞沉淀。再用PBS重悬，将细胞混匀后小心滴加到4mL分离液液面上，1 500r/min离心20min后小心吸取第2层细胞，加入10倍体积的PBS漂洗，1 000r/min离心10min，收集细胞沉淀，以1mL MACS buffer重悬细胞。

1.5.4.2 免疫磁珠法分选骨髓HSC 以MACS buffer漂洗收集的骨髓细胞1次，1 000r/min离心10min，收集细胞沉淀，按细胞数量依次加入缓冲液（100μL/1×107个）和CD44-PE抗体（10μL/1×107个），混匀后4℃避光15min。再加入5mL缓冲液漂洗细胞2次，1 000r/min离心10min，收集细胞沉淀，按比例依次加入缓冲液（80μL/1×107个）和磁珠（20μL/1×107个），混匀后4℃避光15min。加入10倍体积的缓冲液漂洗细胞1次，1 000r/min离心10min，收集细胞沉淀，3mL缓冲液重悬，样本待用。将LS分选柱安装于分选器上，用3mL缓冲液润洗两次，将样本溶液滴入柱中，再以3mL缓冲液润洗两次，留在柱内的即为HSC。将分选柱与分选器分离，加入5mL缓冲液后，迅速推挤出柱内细胞，离心后收集细胞沉淀，计数并计算分选得率。

1.5.5 SA-β-gal染色检测HSC衰老情况 收集细胞，加入SA-β-gal染色固定液1mL，于摇床室温固定15min后离心，PBS清洗3次，每孔加0.5～1mL染色液，于37℃、无CO2孵箱中孵育过夜，次日用PBS漂洗终止反应，倒置显微镜下观察，蓝染细胞即为阳性细胞。400倍显微镜下观察，每组观察3张切片，每张切片观察5个视野，计数每100个细胞中的阳性细胞百分率，取平均值。

1.5.6 流式检测细胞周期 将分选好的HSC用250μL PBS重悬，加入750μL预冷的无水乙醇，-20℃固定过夜。PBS漂洗2遍，加入1mL碘化丙啶染液，室温避光30min，流式细胞仪检测。

1.5.7 CCK-8检测HSC活力 将分选好的细胞用等体积的RPMI 1640培养基重悬，每组吸取100uL的重悬液依次加入到96孔板中，再按10:1的比例加入CCK-8检测液，并充分混匀，设置空白对照孔，37℃避光反应2h，450nm处读取各孔OD值。以OD值反映细胞活力，OD值越大，细胞活力越强。

1.5.8 Western blot检测p16Ink4a-Rb信号通路相关蛋白表达 收集细胞，提取总蛋白，用BCA法测定蛋白浓度，经过电泳，转膜，封闭，一抗孵育，洗膜，二抗孵育，洗膜，最后将PVDF膜置于保鲜膜上，取ECL试剂盒中A液和B液等体积混合，混匀后加在膜的表面，移入凝胶成像分析仪中，化学光敏模式曝光显影。

1.5.9 qPCR检测p16Ink4a-Rb信号通路相关mRNA表达 采用Trizol-离心柱法提取样本总RNA，引物由上海桑尼生物科技有限公司合成、纯化。见表1。反应参数：预加热：95℃ 30s，1 个循环；变性：95℃ 10s，退火（复性）：60℃ 30s，共40个循环。

1.6 统计学分析 应用SPSS 22.0统计软件进行统计学分析，计量资料以±s表示，两组间比较采用t检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组HSC SA-β-gal染色阳性率比较 模型组和龟鹿二仙胶组的SA-β-gal染色阳性率较对照组明显升高，差异有统计学意义（P＜0.01），说明这两组的HSC的衰老程度明显高于对照组；其中龟鹿二仙胶组SA-β-gal染色阳性率低于模型组，差异有统计学意义（P＜0.01）。见表 2、图 1。

表2 各组HSC SA-β-gal染色阳性细胞百分率比较（%）Tab.2 SA-β-gal staining positive rate of HSC in each group(%)

图1 各组HSC的SA-β-gal染色结果（400×）Fig.1 SA-β-gal staining of HSC in each group（400×）

2.2 各组HSC细胞周期检测 各组G1期的细胞比例差异无统计学意义（P＞0.05）；模型组和龟鹿二仙胶组的S期细胞比例高于对照组，差异有统计学意义（P＜0.01）；其中龟鹿二仙胶干预后，S期细胞比例明显低于模型组，差异有统计学意义（P＜0.01）。见表3。

表3 各组HSC细胞周期比较（%）Tab.3 Cell cycle of HSC in each group(%)

2.3 各组HSC细胞活力比较 对照组细胞活力为0.57±0.04，模型组为 0.33±0.17，龟鹿二仙胶组为 0.62±0.14。模型组较对照组明显降低，差异有统计学意义（P＜0.01）；而龟鹿二仙胶组细胞活力较模型组明显升高，差异有统计学意义（P＜0.05）。

2.4 各组HSC p16Ink4a-Rb信号通路相关蛋白表达水平比较 模型组和龟鹿二仙胶组p16蛋白的表达水平较对照组升高，而pRb、CDK4/6蛋白的表达水平较对照组降低，差异均有统计学意义（P＜0.01）；其中龟鹿二仙胶组p16蛋白的表达水平低于模型组，而pRb、CDK4/6蛋白的表达水平高于模型组，差异均有统计学意义（P＜0.05，P＜0.01）。见表 4、图 2。

2.5 各组HSC p16Ink4a-Rb信号通路相关mRNA表达水平比较 龟鹿二仙胶组与模型组比较以及模型组与对照组比较，p16、pRb、CDK4/6 mRNA 表达水平的差异均无统计学意义（P＞0.05）。见图3。

3 讨论

恶性肿瘤发病率和死亡率一直居高不下，严重危害人类健康。国家癌症中心公布的数据显示2018年我国恶性肿瘤新发病例380.4万，占全球恶性肿瘤新发病例总数的26.9%，死亡例数为229.6万，占全球死亡病例总数的28%，可见我国是恶性肿瘤高发国家，仍需要大量的探索研究以攻克恶性肿瘤这个难题。迄今为止，化疗仍然是恶性肿瘤主要的治疗手段，但化疗药物存在较多的副作用，如骨髓抑制、消化道反应、脱发等，严重时可能限制化疗药物的剂量，影响化疗疗效。骨髓抑制是大多数化疗药物的主要副作用，如培美曲塞、氟尿嘧啶[7]等。针对化疗后的骨髓抑制，目前临床上主要应用集落刺激因子治疗，如粒细胞集落刺激因子（granulocyte-colony stimulating factor，G-CSF）、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（granulocyte macrophage-colony stimulating factor，GM-CSF）、促红细胞生成因子（erythropoietin，EPO）、促血小板生成因子（thrombopoietin，TPO）、重组人白细胞介素-11（interleukin-11，IL-11）等，能够一定程度上促使骨髓造血功能恢复，但对于多次化疗后骨髓造血功能抑制明显，或营养状况较差、骨髓造血原料不足的患者，集落刺激因子也难以改善患者骨髓抑制状况。因此开发价廉的中药制剂，在化疗前或化疗同时作为辅助用药，减轻化疗对骨髓造血功能的抑制，确保化疗的顺利完成并减少化疗药物对骨髓造血功能的损害，对于提高化疗疗效和改善患者预后具有重大的意义。

表4 各组HSC p16Ink4a-Rb信号通路相关蛋白表达水平比较（±s）Tab.4 Expression of p16Ink4a-Rb pathway related proteins in each group(±s)

表4 各组HSC p16Ink4a-Rb信号通路相关蛋白表达水平比较（±s）Tab.4 Expression of p16Ink4a-Rb pathway related proteins in each group(±s)

注：与对照组比较，**P＜0.01；与模型组比较，#P＜0.05，##P＜0.01。Note:Compared with control group,**P＜0.01;compared with model group,#P＜0.05，##P＜0.01.

图2 各组HSC p16Ink4a-Rb信号通路相关蛋白表达Fig.2 Expression of p16Ink4a-Rb pathway related proteins in each group

图3 各组HSC p16Ink4a-Rb信号通路相关mRNA相对表达量Fig.3 Expression pf p16Ink4a-Rb pathway related mRNAs in each group

化疗导致骨髓抑制的机制可能有以下三种[8]：第一是诱导HSCs凋亡；第二是导致骨髓基质破坏；第三是促使HSC衰老。其中HSC衰老被认为是骨髓抑制最为关键的机制，而HSC发生衰老的机制尚不十分明确。干细胞具有不断自我更新和分化的能力，抑制其自我更新就可能导致细胞发生衰老。目前认为HSC衰老属于非端粒酶依赖的细胞衰老，其影响因素包括慢性或急性的DNA损伤（主要由辐射引起）、癌基因的激活（如 RAS、HER-2、PTEN等）、氧化应激、表观遗传等[9-11]。CTX是一种双功能烷化剂，作为细胞周期非特异性的抗肿瘤药物，CTX可以诱导DNA交联，抑制DNA合成，从而对细胞周期特别是S期产生巨大影响，目前被广泛应用于体内和体外衰老的研究[12-13]。本研究中发现CTX处理后，HSC细胞活力明显下降、SA-β-gal染色阳性细胞百分率增高，细胞周期阻滞于S期，表明骨髓衰老模型成功建立。

龟鹿二仙胶是我国古代名方，明代王三才所著的《医便》中就有详细记载。方中龟板滋阴潜阳、补血，鹿角胶补肾阳、生精血，人参大补元气而生津，枸杞子益精生血。四药合用，生精、益气、养血，阴阳并补，且补阴而无凝滞之弊，补阳而无燥热之害，属阴阳双补之剂，能养血益气生精。现代医学研究证明，龟鹿二仙胶能够延缓衰老，治疗慢性疲劳综合征，减轻化疗后骨髓抑制，治疗再生障碍性贫血等[14]。笔者前期研究发现龟鹿二仙胶在一定程度上改善了大肠癌骨髓抑制患者的预后[4]，然而其具体的分子机制仍待明确。本研究用龟鹿二仙胶干预后，能够改善小鼠HSC的细胞活力、对细胞衰老以及细胞周期阻滞也有逆转作用。

有研究表明，衰老细胞中CDK抑制剂p16蛋白的表达明显升高[15]，而p16蛋白的表达上调抑制了CDK4/6激活，从而降低Rb蛋白的磷酸化而减少细胞周期相关转录因子E2F基因的表达，导致细胞周期阻滞于G1期并且形成细胞衰老相关的异染色质位点[3]，使衰老进入不可逆阶段。因此激活p16Ink4a-pRb通路会导致细胞周期阻滞于G1期，使细胞自我更新能力下降从而发生细胞衰老。本研究中模型组p16蛋白的表达水平明显升高，同时伴随着pRb、CDK4/6蛋白水平的降低，这正是细胞衰老的特征表现。龟鹿二仙胶干预后，p16蛋白的表达水平明显降低，pRb、CDK4/6蛋白水平明显升高，证实了龟鹿二仙胶可以减轻CTX诱导的HSC衰老。

进一步对p16Ink4a-Rb信号通路上相关mRNA表达水平的分析发现，各组相关mRNA的表达水平差异没有统计学意义。mRNA丰度不一定与其翻译产物蛋白质的表达量成线性关系，蛋白表达和对应mRNA的丰度可能完全无关[16]。从产生层面分析，相同量mRNA在不同翻译效率下产生的蛋白量变化非常大[17]，这依赖于蛋白质翻译后修饰过程，磷酸化、甲基化、乙酰化等修饰过程都能影响蛋白质的功能结构以及基因转录[18]。结合本研究结果，笔者推测p16Ink4a-Rb信号通路上相关基因可能存在翻译水平上的调节，还可能存在其他相关mRNA转录翻译后修饰对p16Ink4a-Rb信号通路相关功能蛋白的影响，从而导致mRNA和蛋白表达不一致。从降解层面分析，RNA稳定性差于蛋白质，特别是富含腺嘌呤/尿嘧啶丰富元件（AU-rich element，ARE）的 mRNA[19]。目前大部分研究者认为mRNA的表达并不足以证明蛋白的表达情况，对于分子水平研究更倾向于以蛋白表达为金标准，因此虽然本研究中mRNA和蛋白质表达水平不一致，仍可证实龟鹿二仙胶对p16INK4a-Rb信号通路的调控作用。p16Ink4a-Rb信号通路相关mRNA是否富含AREs而导致mRNA快速降解还需要进一步探究。

综上所述，本研究证实龟鹿二仙胶能够逆转化疗所致的HSC衰老，其可能的机制是抑制p16Ink4a-Rb信号通路中p16蛋白的表达、增加CDK4/6及pRb蛋白的表达，从而减少细胞周期的阻滞。

:

[1]Weycker D,Barron R,Kartashov A,et al.Incidence,treatment,and consequencesofchemotherapy-induced febrile neutropenia in the inpatient and outpatient settings[J].J Oncol Pharm Pract,2014,20(3):190-198.

[2]汪变红,张明智,付晓瑞,等.化放疗骨髓抑制机制及防治研究进展[J].肿瘤基础与临床,2013,26(2):162-165.WANG Bianhong,ZHANG Mingzhi,FU Xiaorui,et al.Bone marrow inhibition mechanism and prevention-cure research of the radiotherapy and chemotherapy[J].Journal of Basic and Clinical Oncology,2013,26(2):162-165.

[3]Cencioni C,Spallotta F,Martelli F,et al.Oxidative stress and epigenetic regulation in ageing and age-related diseases[J].Int J Mol Sci,2013,14(9):17643-17663.

[4]王珏,魏澹宁,张卫平,等.龟鹿二仙胶巴布剂辅助治疗大肠癌患者化疗后骨髓抑制的临床观察[J].中国中西医结合杂志,2014,34(8):947-951.WANG Jue,WEIDanning,ZHANG Weiping,etal.Clinical observation of adjuvant therapy by guilu erxian glue in bone marrow suppression after chemotherapy of colorectal cancer[J].Chinese Journal of Integrated Traditional and Western Medicine,2014,34(8):947-951.

[5]林胜友,沈敏鹤,陈健,等.龟鹿二仙胶抵抗化疗小鼠脾T淋巴细胞凋亡的实验研究[J].中国中西医结合杂志,2008,28(4):339-342.LIN Shengyou,SHEN Minhe,CHEN Jian,et al.Experimental research of Guilu Erxian Glue resistance to T lymphocyte apoptosis after chemotherapy in mice spleen[J].Chinese Journal of Integrated Traditional and Western Medicine,2008,28(4):339-342.

[6]徐叔云,卞如濂,陈修.药理实验方法学[M].北京:人民卫生出版社,2002:1184.XU Shuyun,BIAN Rulian,CHEN Xiu.Methodology of pharmacologicalexperiment[M].Beijing:People'sMedical Publishing House,2002:1184.

[7]Zheng Y,Fang W,Mao C,et al.Biweekly S-1 plus paclitaxel(SPA)as second-line chemotherapy after failure from fluoropyrimidine and platinum in advanced gastric cancer:a phaseⅡstudy[J].Cancer Chemother Pharmacol,2014,74(3):503-509.

[8]Liu J,Huang X E,Feng J F.Further study on pemetrexed based chemotherapy in treating patients with advanced gastric cancer(AGC)[J].Asian Pac J Cancer Prev,2014,15(16):6587-6590.

[9]马珊珊,姚宁,王欣欣,等.干细胞衰老的调控机制[J].河南医学研究,2015,24(12):56-58.MA Shanshan,YAO Ning,WANG Xinxin,et al.Mechanisms of stem cell senescence[J].Henan Medical Research,2015,24(12):56-58.

[10]Beerman I.Accumulation of DNA damage in the aged hematopoietic stem cell compartment[J].Semin Hematol,2017,54(1):12-18.

[11]Kramer A,Challen G A.The epigenetic basis of hematopoietic stem cell aging[J].Semin Hematol,2017,54(1):19-24.

[12]Park J M,Lee J S,Lee K R,et al.Cordyceps militaris extract protects human dermal fibroblasts against oxidative stress-induced apoptosis and premature senescence[J].Nutrients,2014,6(9):3711-3726.

[13]Sasaki M,Kajiya H,Ozeki S,et al.Reactive oxygen species promotes cellular senescence in normal human epidermal keratinocytes through epigenetic regulation of p16[J].Biochem Biophys Res Commun,2014,452(3):622-628.

[14]王珏,唐朋林.龟鹿二仙胶的现代运用[J].浙江中西医结合杂志,2015,25(10):981-984.WANG Jue,TANG Penglin.Modern applications of guilu erxian glue[J].Zhejiang Journal of Integrated Traditional and Western Medicine,2015,25(10):981-984.

[15]Perez-campo F M,Costa G,Lie-A-Ling M,et al.MOZ-mediated repression of p16INK4a is critical for the selfrenewal of neural and hematopoietic stem cells[J].Stem Cells,2014,32(6):1591-1601.

[16]Chick J M,Munger S C,Simecek P,et al.Defining the consequences of genetic variation on a proteome-wide scale[J].Nature,2016,534(7608):500-505.

[17]Schwanh usser B,Busse D,Li N,et al.Corrigendum:Global quantification of mammalian gene expression control[J].Nature,2013,495(7439):126-127.

[18]阮班军,代鹏,王伟,等.蛋白质翻译后修饰研究进展[J].中国细胞生物学学报,2014,36(7):1027-1037.RUAN Banjun,DAI Peng,WANG Wei,et al.Progress on post-translational modification of proteins[J].Chin J Cell Biol,2014,36(7):1027-1037.

[19]高媛,马大鹏,肖建华.RNA结合蛋白调节mRNA稳定性的作用机制[J].微生物学免疫学进展,2012,40(2):79-83.GAO Yuan,MA Dapeng,XIAO Jianhua.The mechanism of RNA binding protein regulating stability of mRNA[J].Prog in Microbiol Immunol,2012,40(2):79-83.