孤束核中GABAB受体在电针“足三里”抑制一过性食管下括约肌松弛中的作用

浙江中医药大学附属第三医院 杭州 310005

一过性食管下括约肌松弛(transient lower esophageal sphincter relaxation,TLESR)是指非吞咽情况下食管下括约肌（low esophageal sphincter,LES）发生自发性松弛，被认为是胃食管反流病的主要病因[1-2]。而胃扩张是引起TLESR的主要诱因之一[3-4]，胃壁拉伸可通过迷走-迷走反射（vago-vagal reflex）诱发TLESR。孤束核是脑干内接受内脏初级感觉传人信息的重要核团，对迷走-迷走反射具有重要的调控作用[5]。来自胃贲门部的感觉信号通过迷走神经感觉传入纤维投射到脑，其突触末端终止于孤束核[6]，因此孤束核在TLESR的发生机制中扮演着重要的角色。

祖国医学认为，“足三里”是足阳明胃经的合穴，又为下合穴，善治胃腑病证。针刺“足三里”穴对包括食管在内的整个消化系运动功能具有良性调节作用[7]，其传出途径是迷走神经。脑干孤束核作为迷走神经中枢接受冲动，进行综合性调节活动[8]。γ-氨基丁酸受体(γ-aminobutyric acid receptor,GABA-R)广泛存在于中枢孤束核神经细胞中，与其电活动有着密切关系。笔者推测孤束核在参与电针对 TLESR的干预中发挥了重要的作用，而GABAB受体的调控作用可能是其主要机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组 选用SPF级健康雄性SD大鼠30只，购自上海西普尔-必凯实验动物有限公司，动物随机分模型组（胃扩张诱发造模 6只）、足三里组（造模+电针“足三里”6只）、非经非穴组（造模+无效电针6只）、沙克洛芬（Saclofen来源abcam）组（造模+电针“足三里”+GABAB受体阻断剂6只）和空白注射组（造模+电针“足三里”+无效注射 6只）。

1.2 胃扩张诱发TLESR模型 参考相关文献，大鼠禁食10h后，10%水合氯醛(0.35ml/100g体重)腹腔注射麻醉下，轻柔地插一端套有薄膜囊的聚乙烯软管入胃，深度为下食管括约肌下4cm，向气囊内注水，给予胃内压≥5.32 kPa(40mmHg)压力的时相性胃扩张(注水2min，间歇4min，交替进行，6min为1轮，共10 轮[9-10]。

1.3 孤束核内微量注射针的埋入 大鼠在10%水合氯醛(0.35ml/100g体重)腹腔注射麻醉下，固定于立体定向仪上，切开大鼠头部皮肤，暴露骨缝，参照LJ.Pellegrine鼠脑定向图谱，颅骨钻孔,埋植不锈钢套管(外径0.5mm，内置直经0.3mm的不锈钢丝，其下端比套管长0.5mm)，微量注射时，将不锈钢丝内芯拔出，微量注射针超出外套管1mm，用于局部微量注射。

1.4 测压流程 将适度麻醉的大鼠仰卧固定于实验台上，使用消化道动力检测系统GAP-08A，经口插入测压管，使远端3个通道均置于胃内,开始记录测压数据。采用定点牵拉法匀速牵拉（每15s向外牵拉测压管10mm)测压管直至第2或含第3通道，显示位于LES内时,将测压管固定于动物口边。监测TLESR及TLESR伴反流的发生次数。足三里组及非经非穴组在胃扩张的同时电针双侧相关穴位。沙克洛芬（GABAB受体阻断剂）组和空白注射组，在进行电针“足三里”及食管测压前30min，微量注射针连接微量注射泵，以1μl/min的速度向孤束核区注射1μl的沙克洛芬或改良Riger液，注入时程为1min，滞留1min，然后开始测压。

1.5 电针穴位和电针参数 按照中国针灸学会学术部提供的大鼠穴位图谱及比较解剖学取穴“足三里”，采用华佗牌 0.30mm×25mm 针灸针，刺入双侧穴位，连接电子针灸治疗仪CMNS6-1型，频率 2/100Hz连续波，电流1mA，时间60min。模型组仅给予单纯胃扩张，不进行电针。

1.6 TLESR的判定标准 LES从开始松弛到完全松弛的时间≤10s；LES的最低压力应≤2mmHg。此外，对于压力≤2mmHg，松弛时间≥10s的LES松弛，且可以除外是由于多次快速吞咽所致，可以被认为是TLESR。

1.7 TLESR伴反流判定标准 至少2个食管测压导联中压力同时突然持续增加是气体或液体从胃中反流到食管中的标志。

TLESR伴反流率=每组发生反流的总次数/总TLESR次数。

1.8 免疫组化法检测孤束核区GABAB受体的表达用10%水合氯醛(0.35ml/100g体重)腹麻醉大鼠,完全麻醉后开胸通过左心室灌注生理盐水，至右心房流出的液体变清，再用 4%多聚甲醛溶液快速灌注固定，之后继续缓慢固定30min，断头取延髓界沟的外侧（孤束核），标本浸泡于4%多聚甲醛溶液6h，然后于4℃用15%蔗糖溶液脱水24h，标本均沉至容器底部，再用30%蔗糖溶液于4℃脱水48h，标本全部沉底，取出标本，用锡箔纸包裹密封，用液氮迅速冷冻。于恒温冷冻切片机内连续冠状位冰冻片，片厚20μm，用于免疫组化染色，阳性反应产物呈黄褐色，在每只大鼠随机取10张切片，并在200倍光镜下随机选择孤束核区相应部位的5个视野，进行GABAB受体阳性细胞计数。

1.9 统计学分析 采用SPSS 19.0软件对数据进行统计分析，TLESR频率应用中位数表示，其余实验数据以均数±标准差(±s）表示。组内比较采用配对t检验，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较选用LSD检验，以P<0.05为差异有统计学意义的标准。

2 结果

2.1 电针及药物对TLESR频率的影响 与模型组［9次/h（范围：7～11）］相比，足三里组［6次/h（范围：4～8）］TLESR 频率较低（P=0.023<0.05，T=3.248），而非经非穴组［9次/h（范围：7～13）］TLESR 频率差异无统计学意义（P=0.837>0.05，T=0.216）；与空白注射组［9次/h（范围：7～13）］相比，沙克洛芬组［18次/h（范围：15～21）］TLESR 的频率显著升高（P<0.001，T=10.686）。见图 1。

图1 各组发生TLESR频率（次/小时）

2.2 电针对TLESR时合并反流的影响 与模型组相比，足三里组可以降低合并返流的比例（P<0.05），而非经非穴组与模型组相比差异无统计学意义（P>0.05）。与空白注射组相比，GABAB受体阻断剂沙克洛芬组的TLESR合并返流比例显著升高（P<0.001）。见表1。

表1 各组发生TLESR合并反流率

2.3 孤束核区GABAB受体表达 与模型组相比，足三里组孤束核区的GABAB受体阳性面积增加（P<0.05）。与足三里组相比，沙克洛芬组孤束核区的GABAB受体阳性面积减少（P<0.001）。见表2及图2。

表2 各组大鼠孤束核区GABAB受体免疫组化阳性面积

3 讨论

针刺疗法由于其安全有效的优势，在临床上用于治疗胃食管反流病正被越来越多的患者接受。“足三里”穴作为足阳明胃经的合穴、下合穴，是针灸治疗消化系统疾病的常用穴。目前临床研究提示[11-12]，针刺“足三里”等穴来治疗胃食管反流病，可显著改善临床症状，降低复发率。研究显示，针刺“足三里”穴对食管运动有明显的双向调节作用，它既可以提高食管动力障碍患者的食管运动功能，也能缓解食管下括约肌兴奋性增高患者的食管下括约肌痉挛，使吞咽顺畅[13]。Zou等[14]发现电针可通过降低TLESR的频率来改善反流症状。本动物实验结果证实，电针“足三里”穴可有效降低大鼠胃扩张所诱发的TLESR频率，而电针非经非穴则没有上述效果，说明电针“足三里”对食管下括约肌运动功能的调节具有一定的经络和穴位特异性。同时侯晓华等[15]研究发现健康人中35%的TLESR伴随胃食管反流，而胃食管反流病患者则有65%TLESR伴随反流，所以如何防止过多的胃内容物反流入食管减少其食道黏膜损伤亦十分重要。在本动物试验中，发现电针“足三里”在抑制TLESR的同时，能够有效降低其合并反流的发生，为胃食管反流病的治疗提供了理论依据及新的思路。

图2 各组大鼠孤束核区GABAB受体免疫组化染色（200×）

TLESR被认为是胃食管反流病的根本病因，其发生与胃底、咽部的迷走神经机械感受器受到刺激引起的迷走-迷走反射密切相关。有研究发现电针大鼠穴位可以诱发迷走神经放电，并且这种作用可以通过脊髓横断来逆转，提示电针“足三里”对迷走神经的刺激作用有可能是通过中枢的机制而完成的[16]。牟向东等[17-18]发现采用电针刺激“足三里”穴，可使健康大鼠食管下段括约肌压力明显升高，在阻断胆碱能M受体后，电针的干预效果被明显减弱，但电针仍可使LESP恢复至正常水平，说明电针对食管下括约肌的干预效应除迷走神经的胆碱能受体外，还有其他途径。孤束核是脑干内接受内脏初级感觉传人信息的重要核团，接受由迷走神经传入的胃扩张等引发的感觉信号，调控食管下括约肌，在引发TLESR的过程中起重要作用[19]。GABA为抑制性神经递质，而孤束核中存在大量的GABAB受体。对孤束核内GABA能神经末梢的超微结构研究显示GABAB受体和外周传入末梢有紧密的联系[18]，调节孤束核中GABAB受体可影响迷走神经机械感受器，改变迷走神经传出冲动[21]。本研究组猜测电针“足三里”对TLESR的抑制作用可能与孤束核中GABAB受体有关，故本实验设计了应用微注射GABAB受体阻断剂沙克洛芬对实验动物进行预处理，从而观察孤束核中GABAB受体对电针“足三里”穴抑制TLESR作用的影响。结果发现：阻断GABAB受体的沙克洛芬可以逆转“足三里”对TLESR及其合并反流的抑制作用，使TLESR发生及其合并反流频率大幅上升，说明电针“足三里”穴对TLESR的作用与GABAB受体状态有关。因此，GABAB受体在经迷走神经通路调控TLESR的过程中扮演着重要的角色。进一步的免疫组化结果显示，电针“足三里”组与模型组大鼠相比，孤束核中GABAB受体表达上调，两组间差异存在显著性意义，说明电针“足三里”不但可以激动GABAB受体，还能够上调其表达水平。但GABAB受体需要与GABA神经递质相结合才能发挥效应，电针“足三里”穴对孤束核内GABA神经递质含量的影响，仍需进一步的研究。

4 结语

综上所述，本实验表明电针“足三里”可能通过激动孤束核中GABAB受体，影响迷走神经-食管中枢调控机制来恢复LES正常生理功能，减少TLESR发生及其合并反流频率。同时仍需结合传统及现代医学，通过进一步的研究来阐明其作用机制。

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