丹参酮Ⅰ在肾脏缺血再灌注损伤中的保护作用研究

高文强，邱雪峰，李凯，陈蔚，赵晓智，李笑弓，郭宏骞

(1.南京大学医学院附属鼓楼医院 泌尿外科，江苏 南京 210008； 2.东南大学 医学院，江苏 南京 210009)

肾脏缺血再灌注损伤(renal ischemia reperfusion injury,RIRI)是指缺血的肾脏恢复血流灌注后损伤反而加重和功能恶化的现象，常见于心血管手术、创伤、休克、烧伤和器官移植的患者[1-2]，是临床上急性肾损伤(acute kidney injury，AKI)最常见的病因。目前RIRI的治疗以对症支持治疗为主，缺乏特异性治疗手段，探索治疗RIRI的新方法有重要的临床意义。

RIRI是一个复杂的多因素作用的病理生理过程，其具体发病机制目前仍不完全清楚，涉及自由基、钙超载和能量代谢功能障碍等多方面因素，且各因素间又相互转化、相互促进[3]，但目前普遍认为氧化应激损伤在RIRI的病理生理过程中发挥着关键作用[4]，因此，抗氧化应激损伤可作为RIRI治疗的一种有效手段。

丹参酮Ⅰ(Tanshinone Ⅰ，T-Ⅰ)为中药丹参根部的主要有效成分。研究表明，T-Ⅰ能够发挥舒张血管、清除氧自由基、稳定血管内皮功能等药理作用，对脑卒中、心肌缺血、闭塞性动脉炎及动脉粥样硬化等心脑血管疾病具有良好的治疗效果[5-6]，但其在RIRI中的保护作用仍然未知，近期多项研究表明T-Ⅰ 通过激活氧化还原反应相关的防御性通路来发挥抗氧化性[7-9]，提示T-Ⅰ 可能 通过抗氧化作用对RIRI起到保护作用。本研究通过体内、体外两方面探讨T-Ⅰ 在RIRI中的保护作用，希望为RIRI这一临床难题探索新的治疗手段。

1 材料与方法

1.1 实验动物及主要材料

普通雄性ICR小鼠(南京医科大学动物实验中心)；T-Ⅰ、玉米油(C18H12O3，Aladdin公司，中国上海)；超氧化物歧化酶(SOD)试剂盒、脂质过氧化产物丙二醇(MDA)试剂盒(南京建成生物工程研究所)；人肾小管上皮细胞HK-2接种于含10%胎牛血清(美国HyClone公司)的高糖DMEM(美国Gibico公司)培养基中，培养条件为5%CO2、37 ℃，待细胞汇合度达到80%～90%时，用0.25%胰酶进行消化，以1∶3比例进行传代培养。试剂及仪器：酶标仪(美国Biord公司)，CCK-8试剂盒(Vazyme Biotech)，Annexin V-FITC/PI凋亡试剂盒(诺唯赞生物科技有限公司，中国南京)，活性氧检测试剂盒DCFHDA(贝博生物，中国上海)，Tunel细胞凋亡检测试剂盒(美国Roche公司)。

1.2 实验设计

1.2.1 体内实验 将普通雄性ICR小鼠(30～35 g)随机分成假手术(sham)组、sham+T-Ⅰ组、缺血再灌注(IR)组、IR+T-Ⅰ组4组，sham+T-Ⅰ 组及IR+T-Ⅰ 组予腹腔注射T-Ⅰ，剂量为10 mg·kg-1·(48 h)-1[8]，sham组及IR组注射等量玉米油，2周后建立手术模型，小鼠用1%戊巴比妥钠(80 mg·kg-1)腹腔内给药麻醉，腹部正中切口，暴露左侧肾蒂，血管夹阻断左肾血供50 min，切除右肾，逐层关闭切口。sham组及sham+T-Ⅰ组只切除右侧肾脏，不阻断左肾血流,术后48 h留取左肾组织及血清标本。

1.2.2 体外实验 将HK-2按5×104ml-1接种于96孔板或6孔板，37 ℃、5%CO2培养6 h贴壁后，随机分为对照(C)组、T-Ⅰ组、H2O2组、H2O2+T-Ⅰ组4组，T-Ⅰ 组及H2O2+T-Ⅰ组用含T-Ⅰ培养基培养，C组及H2O2组用正常培养基培养，24 h后用H2O2模拟氧化应激模型；H2O2组及H2O2+T-Ⅰ组用含过氧化氢无血清培养基培养，C组及T-Ⅰ组更换无血清正常培养基培养；2 h后检测比较各组细胞活力、细胞凋亡及细胞内活性氧指标。

1.3 小鼠肾功能评估

每组血液样本经离心所得血清存储于-80 ℃冰箱，用作血清尿素氮(BUN)、肌酐(Cr)水平检测，评估肾功能。

1.4 小鼠肾脏组织学分析

用10%福尔马林固定中间部分肾脏组织，脱水并用石蜡包埋。HE染色，随机5 μm厚度切片，对肾脏的损伤程度进行组织病理学评分。评分反映10个随机选择非重叠区域(200倍)的肾组织损伤(包括肾小管坏死、管型形成、肾小管扩张、鲍氏囊扩张、刷状缘消失)所占比例，分级如下：0分，无肾组织损伤；1分，肾组织损伤≤10%；2分，肾组织损伤11%～25%；3分，肾组织损伤26%～45%；4分，肾组织损伤46%～75%；5分，肾组织损伤≥76%[10]。

1.5 小鼠肾脏组织凋亡检测

利用TUNEL细胞凋亡检测试剂盒，将切好的石蜡切片烘烤、脱蜡、再水化，根据说明书步骤检测肾脏细胞凋亡，通过计数10个随机视野内的凋亡细胞所占比例来反映各组小鼠肾脏凋亡情况。

1.6 小鼠肾脏氧化应激指标测定

通过测定肾脏SOD活性及MDA含量来反映小鼠肾脏氧化应激水平，按照SOD及MDA试剂盒相关步骤：小鼠肾脏匀浆后15 min、3 000 r·min-1离心，取上清液分别加入SOD、MDA检测试剂，每个测定重复3遍。

1.7 肾小管上皮细胞活力检测

采用CCK-8试剂盒，将上述处理的96孔板内细胞吸去培养液，用正常培养基洗涤2次，加入含10% CCK-8试剂的培养基100 μl，37 ℃、5%CO2培养2 h后，在450 nm波长测定各组吸光度(A)值，设置不加

细胞只加培养液的空白对照组，比色时作为空白调零孔，每组重复6孔。细胞活力=[A(加药)-A(空白)]/[A(对照)-A(空白)]×100%。

1.8 肾小管上皮细胞凋亡检测

将各组细胞用0.25%胰酶进行消化，PBS洗涤3次后，调整细胞浓度为5×105ml-1，加入预冷的结合缓冲液100 μl重悬细胞，加入5 μl Annexin V-FITC和5 μl PI染色液，轻轻混匀且室温、避光反应10 min；每组加入400 μl结合缓冲液，轻轻混匀后，将样品在1 h内使用流式细胞仪检测。

1.9 肾小管上皮细胞氧化应激指标测量

通过检测细胞内活性氧来反映HK-2氧化应激状态，采用ROS检测试剂盒：将1.2.2中处理的6孔板内细胞除去培养液并用正常培养基洗涤2遍，加入适当体积稀释好的DCFH-DA，37 ℃细胞培养箱内孵育20 min，在激发波长502 nm、发射波长530 nm附近，用荧光显微镜检测DCF荧光，从而测定细胞内ROS水平，然后利用Image J对每组的荧光水平进行定量分析。

1.10 统计学处理

使用SPSS 19.0统计软件对实验数据进行分析，数据以均数±标准差表示，采用Tukey’s检验，P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结 果

2.1 各组小鼠肾功能变化

术后48 h各组小鼠血清Cr、BUN水平如图1所示，sham+T-Ⅰ组与sham组相比血清Cr、BUN水平无明显差异(P>0.05)，IR组血清Cr、BUN水平明显高于sham组、sham+T-Ⅰ组(P<0.05)，IR+T-Ⅰ组血清Cr、BUN水平较IR组明显下降(P<0.05)。

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图1各组小鼠肾脏血清Cr(A)及BUN(B)水平比较

2.2 T-Ⅰ改善RIRI后肾组织病理学改变

通过基于急性肾损伤微观结构的病理评分，包括肾小管坏死、刷状缘消失、管型形成、肾小管扩张等，来判断T-Ⅰ 对RIRI引起的肾损伤的影响。如图2所示，在肾脏皮质及髓质IR组评分均显著高于sham组及sham+T-Ⅰ 组，且与IR组相比，IR+T-Ⅰ 组评分明显较低。

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图2T-Ⅰ改善RIRI后肾组织病理学改变
A.小鼠肾皮质病理学改变；B.小鼠肾皮质组织病理评分；C.小鼠肾髓质组织病理学改变；D.鼠肾髓质组织病理评分

2.3 各组小鼠肾组织细胞凋亡情况

通过TUNEL法检测小鼠肾脏组织中的凋亡细胞，结果如图3所示，褐色核染代表凋亡细胞，IR组以及IR+T-Ⅰ组均可见较多凋亡细胞，且IR+T-Ⅰ组凋亡细胞较IR组显著减少。

2.4 各组小鼠肾脏氧化应激状态

利用肾脏组织中SOD活力及MDA含量来评估肾脏氧化应激水平，如图4所示，与sham组及sham+T-Ⅰ 组相比，IR组SOD显著降低，而MDA水平明显升高，提示IR术后肾脏处于氧化应激状态，而IR+T-Ⅰ组SOD活力较IR组增高，MDA水平下降。

2.5 T-Ⅰ提高肾小管上皮细胞氧化应激损伤后细胞活力

图5A为不同浓度H2O2处理人肾小管上皮细胞2 h后细胞活力变化，根据实验结果，后续实验使用H2O2终浓度为2 mmol·L-1；图5B为T-Ⅰ处理HK-2细胞24 h后细胞活力变化，提示较低浓度(终浓度≤3 μmol·L-1)处理24 h对HK-2没有细胞毒性，后续实验选用T-Ⅰ终浓度为3 μmol·L-1；图5C提示T-Ⅰ对H2O2处理后的HK-2细胞的保护作用，H2O2组与C组及T-Ⅰ组相比细胞活力显著降低(P<0.05)，H2O2+T-Ⅰ组较H2O2组细胞活力明显升高(P<0.05)。

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图3各组小鼠肾脏组织细胞凋亡结果(A)及定量(B)

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图4各组小鼠肾脏SOD活力(A)及MDA含量(B)比较

2.6 各组肾小管上皮细胞凋亡情况

利用Annexin V-FITC/PI双染法检测各组细胞的凋亡情况，结果如图6所示，Q4、Q2分别代表早期及晚期凋亡(图6A)，定量结果(图6B)显示H2O2组细胞凋亡比例较C组及T-Ⅰ组显著增加，而H2O2+T-Ⅰ组较H2O2组有所下降(P<0.05)。

2.7 各组肾小管上皮细胞内活性氧水平变化

利用细胞内活性氧水平来反映各组氧化应激状态，如图7所示，绿色荧光强度与细胞内活性氧水平呈正比，H2O2组细胞内绿色荧光水平显著高于C组及T-Ⅰ 组，而与H2O2组相比，H2O2+T-Ⅰ组细胞内绿色荧光强度明显下降，说明T-Ⅰ预处理可显著缓解H2O2诱导的HK-2内氧化应激状态。

3 讨 论

RIRI是临床常见的病理生理过程，在肾移植、心肺旁路及主动脉旁路手术、出血、创伤、脓毒血症及肾积水中均可出现[11]，尤其在肾移植过程中不可避免地会出现IR损伤，导致AKI，影响移植后肾功能，甚至引

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图5T-Ⅰ减轻H2O2导致的细胞损伤
A.不同浓度H2O2处理2 h后HK-2活力变化；B.不同浓度T-Ⅰ处理24 h后HK-2细胞活力变化；C.T-Ⅰ预处理24 h显著增加H2O2处理后的细胞活力起移植后早期死亡率增高[12-13]。如上所述，RIRI的病理生理过程比较复杂，但目前普遍认为氧化应激在其中发挥着重大作用，是导致肾小管坏死、凋亡及加重局部炎症的主要原因[14]。在缺血过程中，组织缺氧会导致细胞内ATP消耗及次黄嘌呤堆积，血液复流后便产生大量的活性氧自由基(reactive oxygen species，ROS),导致肾小管上皮细胞凋亡及肾脏局部炎症反应[14-15]。因此，抗氧化损伤可作为治疗RIRI的一种重要手段。已有研究表明，抑制氧自由基形成及抗氧化损伤药物在RIRI中起到较好的保护作用[16-18]。

既往研究表明，T-Ⅰ具有强力的抗炎、抗氧化、抗癌作用，由于其分子质量较小且具有良好的脂溶性，可以穿透血脑屏障发挥良好的神经保护作用[9-19]。本实验通过体内及体外两部分研究证明T-Ⅰ在RIRI中的保护作用。体内实验IR术后48 h血Cr、BUN水平及病理组织学评分表明，T-Ⅰ预处理能够显著改善IR术后肾功能及肾脏组织结构变化，各组肾脏组织凋亡检测结果表明T-Ⅰ能够显著减少IR导致的细胞凋亡，保护肾脏组织；体外实验则是通过不同组别HK-2细胞活力以及凋亡比例变化说明T-Ⅰ预处理在H2O2模拟的氧化应激损伤中有保护作用。研究表明，T-Ⅰ具有清除氧自由基、抗氧化作用，本实验经测量氧化应激指标证明，T-Ⅰ通过抗氧化损伤在RIRI中发挥保护作用，体内实验中，IR组SOD活性降低及MDA含量升高说明IR术后肾脏处于强烈的氧化应激状态，而与之相比IR+T-Ⅰ组SOD水平升高、MDA含量下降说明T-Ⅰ有强力的抗氧化损伤作用；体外实验通过检测细胞内活性氧水平反映细胞氧化应激水平，通过比较各组绿色荧光水平可见T-Ⅰ预处理可显著降低H2O2诱导后细胞内活性氧水平，发挥其抗氧化性。有研究表明，T-Ⅰ可以激活体内Keap1-Nrf2-ARE抗氧化信号通路发挥其作用，激活Nrf2之后，可以促进其下游抗氧化基因的表达，发挥抗氧化活性[7-8，20]，我们也将对其作进一步研究。

总之，本实验证明氧化应激损伤在RIRI中发挥重要作用，T-Ⅰ通过抗氧化损伤在RIRI中起保护作用，为RIRI的治疗提供了新的方法及理论依据，也促进了祖国中医药相关学科的前沿研究，或许将来T-Ⅰ或其衍生物会用于RIRI的治疗。

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图6各组间细胞凋亡情况
A.各组间流式细胞仪检测结果；B.定量分析结果

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图7T-Ⅰ缓解H2O2诱导的HK-2内氧化应激水平
A.各组细胞内ROS水平；B.其荧光强度定量

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