邓 虹,雷 燕
(成都大帝汉克生物科技有限公司,成都 611130)
饲用酸度调节剂亦称pH调节剂,是指能够酸化饲料的一类物质。可降低饲料在消化道中的pH,为动物提供最适消化道环境,已在国内外得到广泛应用。是继抗生素之后,与益生素、酶制剂、微生态制剂等并列的重要添加剂,是一种无残留、无抗药性、无毒害作用的环保型添加剂。能保证有益菌群合理生长,病原微生物受到有效抑制,从而达到提高动物生长性能和饲料利用率、增强机体抗病能力的效果[1-3]。目前酸度调节剂不仅应用在仔猪生产中,在家禽、反刍动物上也有积极的效果,市场也出现了各种类型的酸度调节剂。国内外报道的有机酸的检测方法主要有电位滴定法、毛细管电泳法、气相色谱法、液相色谱法等[4-10]。但对苹果酸、乳酸、乙酸、柠檬酸、富马酸、丙酸的同时检测分析还未见报道,本试验建立了高效液相色谱同时测定酸度调节剂中的6种有机酸的方法。
本测定方法中所用试剂均为分析纯,水为GB/T 6682中规定的二级水。磷酸二氢钾:优级纯。磷酸:色谱纯。乙酸标准品:纯度>98%,美国SU⁃PELCO公司。乳酸标准品:纯度>98%,美国SU⁃PELCO公司。柠檬酸标准品:纯度>99%,美国SUPELCO公司。富马酸标准品:纯度>99%,美国SUPELCO公司。苹果酸酸标准品:纯度>99%,美国SUPELCO公司。丙酸标准品:纯度>98%,美国SUPELCO公司。
实验室常用仪器设备。分析天平:感量0.000 1 g。水系滤膜:孔径0.45 μm。有机滤膜:孔径0.45 μm。高效液相色谱仪,配VWD检测器。超声波清洗器。
1.3.1 色谱条件
色谱柱:Sepax GP-C18(150 mm×4.6 mm,5 μm),流动相:0.02 mol·L-1磷酸二氢钾水溶液(用磷酸调节pH=3.5),流速:1.0 mL·min-1,检测波长:214 nm,色谱柱温度:30±1℃,进样体积:10 μL。
1.3.2 混合标准工作液
分别称取0.200 0 g(精确至0.000 1 g)苹果酸,0.200 0 g乳酸,0.200 0 g乙酸,0.200 0 g柠檬酸,0.200 0 g丙酸于100 mL容量瓶中,加20~30 mL蒸馏水溶解,制得溶剂1。称取富马酸标准品0.100 0 g,于100 mL容量瓶中,加蒸馏水溶解后超声30 min,使难溶于水的富马酸完全溶解,冷却后定容,摇匀,取10 mL于溶剂1中。将溶剂1的溶液定容至100 mL,摇匀,此标准储备、液中苹果酸、乳酸、乙酸、柠檬酸、丙酸的浓度均为2.0 mg·mL-1,富马酸的浓度为0.1 mg·mL-1,4℃下储藏,保存期1个月。
试样中苹果酸、乳酸、乙酸、柠檬酸、富马酸、丙酸含量X,以质量分数表示,计算公式见式1。
式(1)中,C—由标准曲线得出的试样中果酸、乳酸、乙酸、柠檬酸、富马酸、丙酸的浓度(mg·mL-1);V—试样溶液总体积(mL);m—试样的质量(g)。
准确称取0.3~1.0 g(精确至0.000 1 g)酸度调节剂样品于100 mL容量瓶,超声30min,冷却后定容,摇匀,0.45 μm滤膜过滤,等待上机。从市场上抽取有标示含量的3个酸度调节剂样品,检测结果色谱图见图1,保留时间在2~11 min。
图1 标准品与样品的高效液相色谱图
分别取混合标准工作液按照上述色谱条件进行色谱分析测定。以各有机酸的峰面积对其所相应的质量浓度进行线性回归,各线性回归方程所对应的曲线即为相应有机酸的标准曲线。所述6种有机酸对应的线性回归方程及相关系数r见表1,方程中Y即为相应有机酸对应的峰面积,X即为有机酸的质量浓度。精密量取溶液为0.01 mg·mL-1的每种有机酸溶液10 μL注入液相色谱仪,连续进样6次,根据标准曲线计算各种有机酸的测得浓度,再计算6次测得浓度的标准偏差,3倍标准偏差即为该酸度调节剂的检测限。
连续检测5次样品1,计算各有机酸测得含量的相对标准偏差(RSD),结果见表2。结果表明,有机酸进样精密度良好,RSD<4%。
在某样品中分别加入不同量的有机酸原料,配成6个已知样,在相同的色谱操作条件下,定量分析,计算,测得各个有机酸的回收率见表3。
表1 6种有机酸的线性回归方程、相关系数、检出限
表2 样品1中有机酸含量的相对标准偏差%
表3 样品1中有机酸的加标回收实验
影响有机酸分离效果主要取决于色谱柱和流动相的选择,色谱柱选用Zorbax Eclipse XDB-C18,Agilent SB-C18和Sepax GP-C18进行分析,发现Sepax GP-C18能很好的分离6种有机酸,特别是乳酸和乙酸的分离;流动相选用pH 2.5的磷酸水溶液,pH 2.7的0.01 mol·L-1磷酸氢二铵溶液,盐酸-乙腈溶液,pH 3.5的0.02 mol·L-1磷酸二氢钾缓冲溶液进行分析,发现磷酸二氢钾缓冲溶液能让分离效果更加优异,而且在11 min内即可完成检测,缩短了检测时间,提高了检测效率。
苹果酸、乳酸、乙酸、柠檬酸、丙酸均易溶于水,前处理直接加入蒸馏水即可。富马酸微溶于水,需要超声或者加热水才能将其在短时间内完全溶解,且富马酸的峰响应值大,需要单独稀释后再加入混合标准液中。
应用建立的方法,从市面上获得已知含量的酸度调节剂进行测定,检测结果见表4。
检测结果表明,本方法能满足对酸度调节剂中苹果酸、乳酸、乙酸、柠檬酸、富马酸、丙酸的测定需求。
表4 已知含量的酸度调节剂检测结果
酸度调节剂中有机酸主要作为饲料的酸味剂被广泛使用,不仅可提高饲料的适口性,促进采食,而且具有防腐保健作用,并可预防饲料被霉菌污染;还具有微生物作用,可减少动物胃肠道中有害微生物的繁殖,同时可降低饲料pH,激活消化酶,有助于消化吸收营养物质,提高饲料转化率,为动物提供能量等功能[11]。由于这些酸被完全代谢,并安全无毒而被许多国家批准用于动物饲料的日粮成分,其发展前景广阔[12]。
[1] 赵先铭,曾清华,丁永忠.酸化剂的作用机理及其应用[J].中国饲料,2002(11):22-23.
[2] 秦圣涛,张宏福,唐湘方,等.酸化剂主要生理功能和复合酸选配依据[J].动物营养学报,2007,19(1):515-520.
[3] 林海丹,邓宇翔,王松波,等.饲用酸化剂的作用机制和应用现状[J].广东饲料,2009,18(5):23-25.
[4] 索德成,李兰,樊霞.饲用酸化剂中甲酸、乙酸、丙酸、乳酸、柠檬酸的同步测定[J].饲料工业,2012,33(21):60-62.
[5] 王洪丽,李成云.气相色谱法测定苜蓿青贮料中的有机酸[J].饲料工业,2008,29(16):58-60.
[6] 任清.衍生化-毛细管气相色谱法同时测定饲料添加剂中富马酸、乳酸和柠檬酸[J].分析化学,2002,30(3):304-306.
[7] 庞新安,万英.反相高效液相谱法测定果品中有机酸[J].中国食物与营养,2007(11):40-41.
[8] 毕丽君,张骊,张鸿发.固相萃取高效液相色谱法分析酱油中的有机酸[J].分析化学,2000,28(11):1 391-1 394.
[9] 谢明,吴莹莹,侯水生.饲料有机酸化剂中乙酸、柠檬酸的高效液相色谱检测分析[J].饲料工业,2004,25(10):48-49.
[10] 吴剑平,商军.高效液相色谱法同时测定复合有机酸化剂中5种成分的含量[J].中国饲料,2008(14):36-39.
[11] 刘瑞,聂黎行,孙焕,等.离子排斥色谱法测定生脉注射液中的有机酸[J].分析化学,2012,40(3):489-490.
[12] 范小娜,黄玲,黄志勤,等.三种羟基羧酸气相色谱法的分离及定量分析[J].江西师范大学学报(自然科学版),2004,28(6):537-539.