CYP3A5通过影响cyclin D1蛋白表达水平促进胰腺癌细胞增殖

朱建伟 孔祥毓 孔凡扬 朱惠云 安薇 吴洪玉 李兆申 金震东

细胞色素450(cytochrome 450，CYP450)是一大类广泛存在的含有一个铁原卟啉Ⅸ血红素的蛋白，与化疗药物耐药及肿瘤的发生发展相关[1]。CYP3A5是CYP450酶超家族中的一员，多篇研究发现CYP3A5多态性与肿瘤易感性及药物代谢相关[2-4]，然而对于CYP3A5在肿瘤发生发展中的作用及其机制研究较少。此外，CYP3A5在不同肿瘤中的作用也不同，它在前列腺癌中表现为癌基因，促进肿瘤细胞增殖[5]；在肝癌细胞中则表现为抑癌基因，抑制肝癌细胞的转移[6]；在胰腺癌中可诱导胰腺癌细胞耐药[7]。本课题组通过对Oncomine数据库检索，发现CYP3A5在胰腺导管腺癌组织中表达增高，提示其可能为癌基因，为此本研究观察CYP3A5基因表达量的变化对胰腺癌细胞增殖的影响，探讨其潜在机制。

材料与方法

一、细胞培养及选择

胰腺癌细胞系BxPC-3、FG、MDA28、8902、PANC1均购于中国医学科学院上海细胞所，常规培养、传代。采用蛋白质印迹法检测5株胰腺癌细胞系CYP3A5蛋白表达量，选取CYP3A5表达较高及较低的2株细胞系用于后续的实验研究。

二、靶向CYP3A5的过表达质粒或siRNA转染及验证

取对数生长期细胞接种于6孔板，使细胞铺满各孔面积的50%，置培养箱中培养24 h，采用Lipofectamine2000转染试剂将靶向CYP3A5的过表达质粒(pLenti-h-CYP3A5-V5-Blast)转染PANC1细胞，以空载质粒(pLenti-CMV-V5-Blast)转染作为对照，质粒购于上海亚载生物公司。将3条靶向CYP3A5的siRNA(siRNA-CYP3A5)转染BxPC-3细胞，以转染不针对任何靶基因的非特异性siRNA(siRNA-NC)作为对照。3条siRNA-CYP3A5购自Sigma公司，序列分别为5′-CCUUGAAAUUAGACACGCATT-3′、 5′-GAGUUAUUCUAAGGAUUUCUACUTT-3′、5′-GGAAGAGAAUACGGUCAUUTT-3′。siRNA-NC序列为5′-UUCUCACCGCGAAUGUCGUTT-3′。以抑制效率最佳的siRNA用于后续实验。

三、胰腺癌细胞增殖能力的检测

1．增殖实验：分别取对数生长期转染CYP3A5过表达质粒、空载质粒的PANC1细胞以及转染siRNA-CYP3A5、siRNA-NC的BxPC-3细胞(2 000个/100 μl)接种96孔板，培养12 h待细胞贴壁后分别培养24、48、72 h，每个时间点设5个复孔。培养到时间点时每孔加入10 μl CCK-8继续培养1 h，上酶标仪测定各孔在波长为450 nm处的吸光度值(A450值)，取均值。

2．克隆形成实验：取上述各组对数生长期细胞接种于6孔板，每孔2 ml培养液，500个细胞，置培养箱培养2周，每隔3 d换培养液，培养结束后加入甲醇固定细胞30 min，加入2 ml 0.1%的结晶紫染色1 h，吸出结晶紫，空气干燥后用肉眼计数细胞克隆数，计算克隆形成率。克隆形成率=(克隆数/接种细胞数)×100%。

四、胰腺癌细胞CYP3A5、cyclin D1、Bcl-2及cyclin E的蛋白表达检测

使用RIPA缓冲液提取细胞总蛋白，BCA法定量蛋白后常规行蛋白质印迹法检测蛋白表达，以α-tublin、actin作为内参。兔抗人CYP3A5、cyclin D1、Bcl-2抗体均以1∶1 000稀释，羊抗兔二抗1∶2 000稀释，鼠抗人cyclin E 1∶1 000稀释，羊抗鼠二抗1∶2 000稀释。最后使用ECL显示免疫反应性条带，应用Image J软件扫描。以目的条带与内参条带灰度值比表示蛋白相对表达量，且将空载质粒转染或siRNA-NC转染细胞的蛋白相对表达量标化为1。CYP3A5抗体购于Proteintech公司，cyclin D1抗体购于Cell signaling technology公司，Bcl-2及cyclin E抗体购于Santa cruze公司。二抗购于西塘生物有限公司。

五、胰腺癌细胞cyclin D1 mRNA表达量检测

采用Trizol试剂(Invitrogen公司)提取细胞总RNA。使用反转录试剂盒反转录成cDNA，上SYBR Green仪行实时定量PCR。PCR反应条件：94℃ 2 min，94℃ 30 s、50℃ 30 s、72℃ 30 s，40个循环，以GAPDH作为内参。cyclin D1正义序列为5′-CCG-CCTCACACGCTTCCTCTC-3′，反义序列为5′-TCC-TCCTCGGCGGCCTTGGGG-3′；GAPDH正义序列为5′-TGCACCACCAACTGCTTA-3′，反义序列为5′-GGCATGGACTGTGGTCATGAC-3′。引物由捷瑞公司合成。经PCR仪自带软件获取产物Ct值，通过2-ΔΔCT公式计算mRNA相对表达量，且将空载质粒转染或siRNA-NC转染细胞的mRNA表达量标化为1。

六、统计学处理

结 果

一、实验细胞株的筛选及鉴定

BxPC-3、FG、MDA28、8902、PANC1 5株胰腺癌细胞的CYP3A5蛋白表达量分别为0.90、0.72、0.74、0.56、0.52，BxPC-3细胞的CYP3A5蛋白表达量最高，PANC1细胞的表达量最低(图1)，因此选取上述2株细胞系行下一步实验研究。

图1 胰腺癌细胞株BxPC-3(1)、FG(2)、MDA28(3)、8902(4)、PANC1(5)的CYP3A5蛋白表达

CYP3A5过表达组、空载质粒组PANC1细胞的CYP3A5蛋白表达量分别为1.66±0.14、1.00，过表达组显著高于空载质粒组，差异有统计学意义(t=7.1,P=0.0021，图2)。

3个siRNA-CYP3A5转染组的BxPC-3细胞CYP3A5蛋白表达量分别为0.44±0.032、0.38±0.037、0.18±0.02，较siRNA-NC转染组的1.00显著下调，差异均有统计学意义(t值分别为15.64、16.62、24.05，P值均<0.0001)。因siRNA3-CYP3A5的抑制效率最佳，因此选取siRNA3用于后续研究(图2)。

图2 空载质粒组(1)、CYP3A5过表达组(2)PANC1细胞及siRNA-NC组(3)、3个siRNA-CYP3A5组(4～6)BxPC-3细胞的CYP3A5蛋白表达

二、上调CYP3A5表达促进胰腺癌细胞增殖

CYP3A5过表达组与空载质粒组PANC1细胞培养24、48、72 h的A450值分别为0.73±0.05与0.71±0.05、1.36±0.05与1.15±0.03、2.10±0.09与1.42±0.03，过表达组48、72 h时的A450值显著高于空载质粒组，差异均有统计学意义(t=3.62，P=0.0067；t=6.92，P=0.0001)。

siRNA-CYP3A5转染组与siRNA-NC转染组BxPC-3细胞培养24、48、72 h 的A450值比较分别为0.44±0.03比0.45±0.02、0.62±0.01比0.77±0.03、0.83±0.01比1.18±0.02，siRNA-CYP3A5转染组48、72 h时的A450值显著低于siRNA-NC转染组，差异均有统计学意义(t=3.5，P=0.0085；t=14.54，P<0.0001)。

过表达组PANC1细胞克隆形成率为(19.33±0.58)%，显著高于空载质粒组的(9.67±0.63)%，差异有统计学意义(t=11.22，P=0.0004)；CYP3A5-siRNA组克隆形成率为(8.5±0.8)%，显著低于siRNA-NC组的(16.0±0.6)%，差异有统计学意义(t=7.35，P=0.0018，图3)。

图3 空载质粒组(3A)、CYP3A5过表达组(3B)PANC1细胞及siRNA-NC组(3C)、siRNA-CYP3A5组(3D)BxPC-3细胞的克隆形成

三、CYP3A5通过上调cyclin D1蛋白表达促进胰腺癌细胞增殖

过表达组PANC1细胞cyclin D1蛋白表达量为2.00±0.11，显著高于空载质粒组的1.00，差异有统计学意义(t=8.043，P=0.0013)，而cyclin D1 mRNA表达量为1.06±0.01，与空载质粒组的差异无统计学意义；siRNA-CYP3A5组BxPC-3细胞cyclin D1蛋白表达为0.45±0.04，显著低于siRNA-NC组的1.00，差异有统计学意义(t=11.95，P=0.0003)，而cyclin D1 mRNA表达量为1.09±0.03，与siRNA-NC组的差异无统计学意义(图4)。此外，过表达组PANC1细胞或siRNA-CYP3A5转染组BxPC-3细胞的cyclin E及Bcl-2蛋白及mRNA表达量与各自对照组的差异无统计学意义。提示上调或抑制CYP3A5表达仅在蛋白层面调节cyclin D1基因，进而促进胰腺癌细胞的增殖。

图4 空载质粒组(1)、CYP3A5过表达组(2)PANC1细胞及siRNA-NC组(3)、siRNA-CYP3A5组(4)BxPC-3细胞cyclin D1、cyclin E及Bcl-2蛋白的表达

讨 论

前期对CYP3A5的研究主要集中于该基因与获得性耐药、基因多态性、外源性或内源性基因的代谢及致癌物代谢之间的关系，表明CYP3A5的多态性与癌症风险或肿瘤获得性耐药相关。

本课题组通过生物信息学方法对Oncomine数据库中的数据进行统计学分析，发现胰腺癌组织CYP3A5 mRNA表达量上调，提示CYP3A5在胰腺癌中可能发挥促进肿瘤发生发展的作用。为了进一步明确其作用，本研究通过RNA干扰技术对高表达CYP3A5的BxPC-3进行siRNA转染以抑制CYP3A5表达，而通过CYP3A5过表达质粒对低表达CYP3A5的PANC1细胞进行转染以过表达CYP3A5。通过CCK-8法及克隆形成实验观察胰腺癌细胞的增殖。结果显示，抑制CYP3A5表达能抑制胰腺癌细胞的增殖，CYP3A5过表达能加快胰腺癌的增殖，表明CYP3A5作为癌基因在胰腺癌中发挥促进肿瘤细胞增殖的作用。

肿瘤细胞增殖加快主要表现在其细胞周期失调和凋亡减少。cyclin D1是细胞周期G1期重要的正向调控基因，在多种肿瘤细胞高表达，参与肿瘤的发生及发展，且其过表达与肿瘤转移及患者生存期缩短密切相关[8-10]。本研究结果显示，过表达CYP3A5蛋白可上调cyclin D1蛋白表达，而抑制CYP3A5蛋白表达可下调cyclin D1蛋白表达，但均不影响CYP3A5 mRNA 的表达，推测CYP3A5蛋白是在转录后层面影响cyclin D1蛋白表达，进而促进胰腺癌细胞的增殖。

参 考 文 献

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