利用癌症基因组图谱对乳腺癌患者CDH1基因突变分析*

林 琳 倪 楠 赵海鹰 姜晓峰 涂 巍*

近年来，乳腺癌在我国城市地区的发病率逐年上升，居女性癌症的前3位[2]。乳腺癌的病因尚不明确，可能与脂肪及酒精摄入、女性初潮年龄普遍提前及停经年龄推后、初产妇年龄增大及生产胎数下降等因素密切相关。有研究表明，基因突变与乳腺癌的发生、发展以及预后都密切相关[3-7]。

E-钙黏蛋白(E-cadherin，CDH1)是Ca2＋依赖性细胞粘附分子，编码CDH1基因在1995年首次被克隆，其位于染色体16q22.1，基因全长约100 kb，由16个外显子和15个内含子组成，在物种间高度保守，其编码蛋白包含882个氨基酸，蛋白通过介导细胞粘附和信号转导，参与细胞形态发生和组织分化等生物学行为[8]。有研究发现，在遗传性弥漫型胃癌、卵巢癌中都发现CDH1基因突变病例[9-11]。而CDH1突变与乳腺癌的相关性研究鲜有报道。为此，本研究通过癌症基因组图谱(the cancer genome atlas，TCGA)公共数据集，研究乳腺癌中CDH1突变的发生，为乳腺癌的诊断和治疗提供有价值的线索。

1 材料和方法

1.1 一般资料

选取TCGA数据库中1988-2013年诊断的乳腺癌病例，数据的使用符合TCGA官方网站(https：//tcga-data.nci.nih.gov/docs/publications/tcga/)的出版要求。入选的1098例患者，按照CDH1是否发生突变分为野生型CDH1基因未突变组(986例)，年龄26～90岁，中位年龄58岁；突变型CDH1基因突变组(112例)，年龄34～90岁，中位年龄61岁，肿瘤位置、美国癌症联合委员会(AJCC)肿瘤分期、发病人种等临床资料见表1。

1.2 观察与评价指标

应用cBioPortal网站(http：//www.cbioportal.org/)分析TCGA数据集中CDH1突变情况、CDH1基因拷贝数与信使核糖核酸(messenger ribonucleic acid，mRNA)表达的关系及基因共表达分析。

1.3 统计学方法

生存分析采用cBioPortal网站提供的Kaplan-Meier和log-rank检验法，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 CDH1突变

1098个病例中，CDH1突变112例，占比10.4%，其中Q23*突变最多，共6例，P127Afs*41和R63*突变各4例，E243K、R335*及X722_splice各3例，N166Mfs*49、Q195*及X646_splice各2例，另有72个病例突变位点各不相同(见表2)。

表1 1098例乳腺癌患者临床特征(例)

表2 112例CDH1突变患者的CDH1突变结果(例)

2.2 CDH1基因拷贝数与mRNA表达的关系

应用cBioPortal网站分析乳腺癌TCGA数据集，研究CDH1基因mRNA表达水平与其基因拷贝数量和突变的变化，基因拷贝数量的增加，其mRNA表达增多，但拷贝数到达一定程度后，mRNA表达水平变化不明显，同时，突变会导致CDH1 mRNA表达的下降(如图1所示)。

图1 CDH1基因拷贝数与mRNA表达关系示图

2.3 基因共表达分析

应用cBioPortal网站分析乳腺癌TCGA数据集，进行基因共表达研究结果显示，AP1G1、CTCF、IST1、C16ORF70等基因mRNA与CDH1表达呈现一定程度的正相关(如图2所示)。

图2 CDH1 基因共表达分析示图

2.4 患者生存期分析

应用cBioPortal网站分析乳腺癌TCGA数据集，采用Kaplan-MeierPlotter在线数据进行患者生存分析结果显示，CDH1突变组与未突变组生存期差异无统计学意义(如图3、图4所示)。

图3 乳腺癌患者的总生存期

图4 乳腺癌患者的无病生存期

2.5 调控网络分析

cBioPortal整合来自人参考蛋白质数据库(human reference protein database，HRPD)，Reactome，国立癌症研究所(National Cancer Insititue，NCI)自然版(Nature)和斯隆-凯特琳癌症中心(The Memorial Sloan-Kettering Cancer Center，MSKCC)Cancer Cell Map的数据进行分析，此调控网络中包含51节点，包含CDH1和其50个相关基因，可见CDH1主要通过PI3K/AKT发挥生物学作用，分析结果如图5所示。

图5 调控网络示图

3 讨论

CDH1是钙黏蛋白家族的重要成员之一，介导基底膜细胞间的连接，其异常表达会降低细胞间的粘附作用，使细胞易于与周围组织分离，与肿瘤细胞转移密切相关，其相关机制主要为：①上皮间充质细胞转化；②Wnt信号通路；③Jak-STAT信号途径；④EGFR信号通路。同时，CDH1基因突变、单核苷酸多态性、启动子甲基化及转录异常调控与与肿瘤的发生、发展及转移的关系密切[12-14]。

CDH1的缺失会促进原发肿瘤的早期生长和继发肿瘤的增殖生长，并能够引起肿瘤的侵袭转移[15]。在多种肿瘤中，CDH1的缺失与肿瘤的预后、肿瘤进展和转移都密切相关[16]。有研究发现，CDH1基因突变会引起癌细胞中CDH1表达缺失，对肿瘤的侵袭和转移扩散产生重要的影响[17]。近年来研究表明，乳腺癌组织中，CDH1的表达调控与其增殖、浸润和转移密切相关，CDH1对乳腺癌的侵袭、转移起到促进作用[18-20]。CDH1生成减少是细胞发生上皮-间质转换(epithelial-mesenchymal transition，EMT)的关键步骤，细胞发生EMT时，可导致细胞间的紧密连接减弱，上皮细胞拥有间质细胞的特性从而获得侵袭和转移能力，此时，上皮细胞表型的标志物CDH1等的表达减少，间质细胞表型的标志物N-钙黏素和波形蛋白等的表达增多。

本研究显示，CDH1突变与乳腺癌的发生有一定程度的相关性。结果表明，CDH1突变总数较多，但是突变位点并不集中，这些突变的发生皆导致CDH1表达的下调或缺失，导致CDH1表达下降，从而对乳腺癌的发生和发展起到一定的促进作用。基因共表达研究还发现AP1G1、CTCF、IST1及C16ORF70等基因mRNA与CDH1表达呈现一定程度的正相关。已有研究表明，CTCF与乳腺癌细胞的凋亡和转移相关[21-22]。AP1G1、IST1及C16ORF70这3个基因目前尚无报道称其与乳腺癌发病相关，相关机制还需要进一步研究。

乳腺癌根据分型采取不同的治疗方案，但目前尚无个体化以及更有针对性的治疗方案，这些初步研究为进一步探讨CDH1基因突变与乳腺癌的发生和发展奠定了一定的基础，为乳腺癌发病机制以及靶向治疗提供新的思路。

[1]Siegel RL，Miller KD，Jemal A.Cancer statistics，2017[J].CA Cancer J Clin，2017，67(1)：7-30.

[2]Linos E，Spanos D，Rosner BA，et al.Effects of reproductive and demographic changes on breast cancer incidence in China：a modeling analysis[J].J Natl Cancer Inst，2008，100(19)：1352-1360.

[3]王洪义，吕有勇.乳腺癌p53基因突变规律及其预后意义[J].实用肿瘤杂志，2000，15(5)：307-309.

[4]赖春宁，王建安，黎燕，等.186例乳腺癌患者BRCA1基因突变检测[J].中华肿瘤杂志，2001，23(6)：483-485.

[5]陈营，朱旬，肖莉，等.乳腺癌PIK3CA基因热点突变的研究[J].中华肿瘤防治杂志，2013，20(7)：505-508.

[6]马志萍，王雯，张巍.三阴性乳腺癌33例患者BRCA1/2基因突变状态及临床病理学特征[J].中华病理学杂志，2016，45(6)：397-400.

[7]邓粤敏，徐韫健.PIK3CA基因突变状态在乳腺癌不同临床病理特征中的研究[J].国际检验医学杂志，2016，37(15)：2110-2111.

[8]Berx G，Staes K，van Hengel J，et al.Cloning and characterization of the human invasion suppressor gene E-cadherin(CDH1)[J].Genomics，1995，26(2)：281-289.

[9]Kaurah P，MacMillan A，Boyd N，et al.Founder and recurrent CDH1 mutations in families with hereditary diffuse gastric cancer[J].JAMA，2007，297(21)：2360-2372.

[10]姜勇，万远廉，王振军，等.遗传性弥漫型胃癌上皮型钙黏素基因种系突变的检测[J].中华外科杂志，2004，42(15)：914-917.

[11]姜伶俐，辛晓燕，周洁晶，等.上皮性卵巢癌中CDH1基因突变/甲基化对上皮型钙黏附素表达的影响[J].山西医科大学学报，2010，41(3)：214-218.

[12]谭勇川，贾钰铭，雷开键.CDH1基因与卵巢癌[J].川北医学院学报，2015(6)：896-901.

[13]Shen ZS，Zhou CC，Li JY，et al.The association，clinicopathological significance，and diagnostic value of CDH1 promoter methylation in head and neck squamous cell carcinoma：a meta-analysis of 23 studies[J].Onco Targets Ther，2016，9：6763-6773.

[14]Cardoso MFS，Castelletti CHM，Lima-Filho JL，et al.Putative biomarkers for cervical cancer：SNVs，methylation and expression profiles[J].Mutat Res，2017，773：161-173.

[15]Beavon IR.The E-cadherin-catenin complex in tumour metastasis：structure，function and regulation[J].Eur J Cancer，2000，36(13 Spec No)：1607-1620.

[16]Kowalski PJ，Rubin MA，Kleer CG.E-cadherin expression in primary carcinomas of the breast and its distant metastases[J].Breast Cancer Res，2003，5(6)：R217-R222.

[17]Becker KF，Atkinson MJ，Reich U，et al.E-cadherin gene mutations provide clues to diffuse type gastric carcinomas[J].Cancer Res，1994，54(14)：3845-3852.

[18]Li P，Sun T，Yuan Q，et al.The expressions of NEDD9 and E-cadherin correlate with metastasis and poor prognosis in triplenegative breast cancer patients[J].Onco Targets Ther，2016，9：5751-5759.

[19]Wang R，Li Z，Guo H，et al.Caveolin 1 knockdown inhibits the proliferation，migration and invasion of human breast cancer BT474 cells[J].Mol Med Rep，2014，9(5)：1723-1728.

[20]Palen K，Weber J，Dwinell MB，et al.E-cadherin re-expression shows in vivo evidence for mesenchymal to epithelial transition in clonal metastatic breast tumor cells[J].Oncotarget，2016，7(28)：43363-43375.

[21]Venkatraman B，Klenova E.Role of CTCF poly(ADP-Ribosyl)ation in the regulation of apoptosis in breast cancer cells[J].Indian J Med Paediatr Oncol，2015，36(1)：49-54.

[22]Mustafa M，Lee JY，Kim MH.CTCF negatively regulates HOXA10 expression in breast cancer cells[J].Biochem Biophys Res Commun，2015，467(4)：828-834.