抽真空法和甘油冷冻法保存对高效脱胶菌株CXJZU－120活化性能的比较研究

冯湘沅，成莉凤，刘正初，郑科，杨琦，刘志远，曾洁，段盛文，彭源德

（中国农业科学院麻类研究所，长沙410205）

以微生物为对象的研究和生产中菌种是必不可少的材料［1］。然而菌种具有易变异的特性，当长期使用以及多次转代时，都会导致其活力降低［2］。为了降低菌种死亡率、退化率，保持其原有的优良性状，必须对菌种进行保存［3－5］。菌种传统保存方法主要有转接斜面低温保藏法、液体石蜡保藏法、甘油培养物保藏法、半固体穿刺保藏法、沙土管保藏法、液氮超低温保藏法和真空冷冻干燥保藏法等［6－7］。其中，有些方法虽能长期保存，但所需设备较多，操作复杂；还有些方法尽管比较简单，但保存时间较短，频繁转代，容易变异。根据菌株特性，本研究探究了一种操作简单、保存时间长、性状稳定的菌种保存方法。

高效脱胶菌株CXJZU－120是由中国农业科学院麻类研究所选育。1993年分离得到一个野生菌株T85－260，1996年通过基因工程手段将同种“LY”菌株质粒转化至该菌株得到变异菌株CXJZ95－198，2005年再经过紫外线诱变而获得该变异菌株。2006年以来其在高效节能清洁型苎麻生物脱胶示范工程中推广应用。本文拟采用抽真空法和甘油冷冻法两种方法保存高效脱胶菌株CXJZU－120［8］，保存一段时间后进行活化、培养以及脱胶性能比较，以建立一套保存时间长、性状稳定、操作简单、不需较多设备的高效脱胶菌株保存方法。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

抽真空法保存10年菌株：2007年10月抽真空法保存的高效脱胶菌株CXJZU－120（经鉴定命名为Erwinia carotovora）。

抽真空法保存3年菌株：2014年10月抽真空法保存的高效脱胶菌株CXJZU－120。

甘油冷冻法保存3年菌株：2014年10月甘油冷冻法保存的高效脱胶菌株CXJZU－120。CK：不添加菌液的对照组。

原料：2015年种植、收获的苎麻韧皮原麻。

活化培养基：牛肉浸膏0.5%、葡萄糖1%、蛋白胨0.5%、氯化钠0.5%。

扩大培养基：豆饼粉1%、K2HPO40.1%、（NH）4H2PO40.1%、MgSO4·7H2O 0.05%。

固体培养基：营养琼脂4.5%、葡萄糖0.5%。

试剂：罗威邦（Lovibond）COD专用试剂

1.2 主要仪器

OLYMPUS显微成像分析系统仪：BX53型，日本奥林巴斯公司；生化培养箱：SPX－250B－Z型，上海博迅实业有限公司；全温振荡器：RH－Q型，宁波赛茵仪器有限公司；COD测定仪：ET99718型，德国罗威邦公司；真空泵：2XZ－1型，浙江黄岩求精真空泵厂。

1.3 菌种保存方法

1.3.1 抽真空法

首先挑取纯化典型单菌落菌苔，划线于试管斜面固体培养基，然后将试管放置于恒温培养箱35℃培养20 h，套入大试管，塞上橡胶空心玻璃管，在大试管与橡胶交界处涂抹石蜡并真空泵抽真空，最后用酒精喷灯烧结空心玻璃管封存。

1.3.2 甘油冷冻法

首先挑取纯化典型单菌落，接种于6 mL活化培养基中，混匀，将其置于恒温培养箱中35℃培养6 h，然后倒入盛有100 mL扩大培养基摇瓶中，摇瓶置于35℃，180 r／min摇床培养6 h后，取等体积的菌液和甘油（浓度30%）混合，最后置于－70℃冰柜冷冻保存。

1.4 活化态菌液制备

取抽真空法保存3年、10年菌株菌苔各1环及甘油冷冻法保存3年的200μL解冻菌液分别加入到5 mL活化培养基中，35℃培养10 h后，取上述1 mL菌液稀释涂布于固体培养基平皿，35℃培养20 h，取活化态典型单菌落接入6 mL活化培养基中，混匀，35℃培养6 h后，倒入至100 mL扩大培养基中，35℃、180 r／min培养6 h，按2%的接种量转接至200 mL扩大培养基中，35℃培养 6 h［9］。

1.5 接种与脱胶

取6 mL活化态菌液放入盛有300 mL自来水（预热至35℃）的锥形瓶中，混匀，投入30 g苎麻（卷成圈状），置于35℃、180 r／min全温振荡器发酵。

1.6 取样及样品处理

苎麻韧皮通过接种后分别在0.5、2.5、4.5、6.5、8.5、10.5 h取发酵液样品（5 mL／瓶，立即用等量无菌水补充，3个重复）进行活菌量、COD检测，并观察苎麻分散程度，同时设置对照组CK（不添加菌液）。

取10.5 h发酵后的苎麻瓶，置于灭菌高压锅中于100℃下灭活30 min，待发酵苎麻自然冷却至室温，用清水摆洗，将洗涤的苎麻纤维置于室温下自然风干，测失重率。

1.7 性能鉴定［10］

1.7.1 镜检

采用草酸铵－结晶紫染色，显微成像分析系统仪下观察活化液菌体形态、颜色深浅。

1.7.2 活菌量

采用常规稀释平板涂布法分离，观察平板菌落生长数量，每个级别设置3个重复平皿。1.7.3 COD

德国Lovibond，ET99718型COD测定仪，按使用说明书操作。

1.7.4 失重率

苎麻初始重量G0，菌液处理后的苎麻重量G1（计算3组平均值）。失重率计算公式为：G（%）＝［（G0－G1）／G0］×100%

2 结果与讨论

2.1 活化菌液镜检比较

如图1（随机视野显微照片）所示，抽真空法保存3年或10年菌株活化菌液均为颜色较深的菌体，表明其均可活化出正常菌体，同时也可看到少量形态不规则菌体。而甘油冷冻法保存3年菌株的活化菌液中除有少量形态不规则菌体外，明显可见颜色深浅不一的菌体，从5个视野数出浅色菌体的数量占平皿菌体总量的23.62%，浅色菌体可认为是死亡菌体躯壳或活性能力不强的菌体。因此，抽真空法比甘油冷冻法更适合用于保存高效脱胶菌株CXJZU－120。

图1 活化菌液显微照片Fig.1 Themicrograph for activated bacteria solution

2.2 发酵液活菌量比较

将CXJZU－120活化态菌液接种到苎麻上进行浸泡振荡发酵，在该过程中测定其活菌量（LgN）。由图2所示，抽真空法保存3年、10年的两支菌株的活菌量（LgN）变化趋势基本相同，均随发酵时间的延长显著增加，数值比较接近，10.5 h活菌数（N）均可达最大值1.02×109cfu／mL，说明采用抽真空法保存10年其活性比较稳定，活化后的菌株都能较快适应培养环境。而甘油冷冻法保存3年的菌株由初始活菌数5.25×104cfu／mL（0.5 h发酵时间）增加至活菌数1.66×107cfu／mL（10.5 h），增长缓慢且数值偏低。其主要原因可能是有些菌体实际存在，但活性不强，或是有些菌体从休眠状态恢复到正常生长繁殖状态需要较长时间，对培养环境适应较慢。为了避免苎麻原料带来的杂菌对试验造成的影响，采用不添加菌液组作为对照组（CK），10.5 h其杂菌活菌数为1.07×105cfu／mL，远低于两种保存方法的活菌数，这也进一步证明抽真空法可对CXJZU－120菌株进行中、长期保存。

图2 发酵液活菌量比较Fig.2 Comparison of the bacteria number in the fermentation broth

2.3 发酵液COD比较

COD是表示水中有机物组分含量的一个指标，COD值越大，表明发酵液中残存苎麻降解物越多。由图3可知，抽真空法保存3年、10年的两支菌株发酵0.5 h的起始COD值分别为1.97、1.92 g／L，当时间延长至10.5 h，终止COD值分别达到6.02、5.65 g／L，表明随着脱胶过程的进行，菌株不断地降解苎麻韧皮非纤维素物质而使生成的有机物越来越多。另外，6.5 h时，观察到苎麻纤维完全分散，能完成脱胶。甘油冷冻法保存3年的菌株经活化接种后，脱胶过程中COD值随时间的延长而缓慢上升，10.5 h的发酵液COD值为3.96 g／L，此时苎麻纤维尚未全部分散，说明高效脱胶菌株的脱胶性能对超低温冷冻较为敏感。为了避免水溶物质或杂菌对试验的影响，以不添加菌液组作为对照组，其COD值由1.78 g／L（0.5 h）缓慢上升至2.45 g／L（6.5 h）后呈平稳状态，其COD值远低于两种保存方法活化菌的值，说明两种方法保存的菌株对苎麻均具有脱胶效果，但抽真空法保存的菌株对苎麻的脱胶效果更好。

图3 发酵液COD比较Fig.3 COD comparison of the fermentation broth

2.4 失重率比较

以接入两种方法保存的活化态菌液组为试验组，不添加菌液组为对照组，加入一定量的苎麻发酵10.5 h，取出苎麻，测其质量，并计算失重率，结果如表1所示。抽真空法保存3年、10年的菌株处理的苎麻失重率分别为27.37%和27.10%（苎麻胶质含量一般为25%～35%），基本达到了苎麻脱胶效果。而甘油冷冻法保存3年菌株及对照组的失重率分别为19.53%、13.23%，均低于苎麻胶质含量范围。说明抽真空法可保持菌株的高效脱胶性能，且不随保存时间延长而明显降低。

表1 苎麻失重率测定结果Tab.1 Weight loss during degumming

3 结论

采用抽真空法和甘油冷冻法保存的高效脱胶菌株CXJZU－120，经活化后接种到苎麻上进行脱胶性能比较，结果如下：

（1）抽真空法保存3年、10年的高效脱胶菌株加入活化培养基活化培养10 h后，取样镜检，均能观测到颜色较深的菌体。活化态菌液接种到苎麻上发酵10.5 h的活菌数达到1.02×109cfu／mL以上，苎麻纤维完全分散，质量减少27%以上。COD均随发酵时间的延长大幅度增加，表明菌株活性保存完好。

抽真空法保存10年的菌株可不用转代，容易活化，性能稳定，操作与技术难度不大，适合中、长期保存。

（2）甘油冷冻法保存3年的高效菌株经活化培养10 h进行镜检，菌体颜色深浅不一。尽管发酵液活菌数、COD均随发酵时间的延长而增加，但变化缓慢，10.5 h的苎麻质量仅减少19.53%，尚未全部脱胶。

甘油冷冻法虽配方简单，操作容易，时间耗费少，但活化时间和要求难以掌握，只适合短期保存。

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