法舒地尔对野百合碱诱导的肺动脉高压大鼠炎症反应的影响

刘焕龙 陈雪彦 杨秀岭 尹宪秋 张志清

(河北医科大学第二医院药学部，河北 石家庄 050000)

肺动脉高压(PAH)是一种致残率和病死率均很高的临床综合征，呈进行性加重，以肺血管阻力升高为特征，与血管收缩、管壁重塑及原位血栓形成三种因素的综合作用有关，但确切发病机制尚未明确。免疫炎症因素在多种类型PAH形成及血管重塑过程中起着关键性作用，有学者提出〔1〕肺部炎症细胞浸润及炎症破坏，是无缺氧时肺血管重建和血流动力学指标改变的重要因素，另外缺氧时期炎症因子可进一步介导和调控肺血管构型重建，炎症治疗可能成为未来PAH治疗的一个新的方向〔2〕。但免疫炎症反应参与肺动脉重构的确切机制仍需进一步阐明。研究发现Rho/ROCK信号通路可能参与多种原因引起的PAH形成过程〔3〕，此通路的异常活跃也促进了炎症反应的发生，诱导炎性细胞骨架蛋白的运动，在炎症的多个环节都发挥重要作用，包括炎症细胞的迁移、趋化及浸润〔4〕。Rho激酶抑制剂法舒地尔通过阻断肌球蛋白轻链(MLC) 磷酸化，抑制血管平滑肌的收缩，舒张血管，降低血管阻力。随着Rho/ROCK信号转导通路在PAH机制中的研究深入，该药可能成为预防和治疗PAH新的选择药物之一，但其具体作用机制还有待进一步阐明。本文探讨法舒地尔对野百合碱(MCT)诱导的PAH大鼠的炎症反应的影响。

1 材料与方法

1.1动物、药品与试剂、仪器 清洁级雄性SD大鼠30只，体重180～200 g，由河北医科大学实验动物中心提供，合格证编号：1503015。MCT购自美国Sigma公司；盐酸法舒地尔注射液购自天津红日药业股份有限公司，生产批号：1401101；大鼠白细胞介素(IL)-6、TNF-α和MCP-1酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒购自欣博盛生物科技有限公司。BL-420F生物信号分析系统购自成都泰盟科技有限公司；DM2500病理图像分析系统购自德国莱卡；Floustar多功能微板分析仪购自德国BMG公司。

1.2方法

1.2.1实验动物分组及处理 30只大鼠随机分为对照组，模型组，法舒地尔组，每组10只。模型组和法舒地尔组分别一次性皮下注射MCT 60 mg/kg，4 w可形成PAH。对照组皮下注射等量生理盐水。法舒地尔组自注射MCT之后1 w起以法舒地尔(15 mg/kg)腹腔注射，每日1次。对照组和模型组给予等量生理盐水。3 w后达到实验终点，进行各项指标的测定。

1.2.2血流动力学指标的测定 参照文献〔5〕方法测定肺动脉压(PAP)和体循环压(SAP)。右心导管预充肝素生理盐水后与三通管相连，再经生物换能器与生理记录仪相连。大鼠称重，腹腔注射3%的戊巴比妥钠麻醉，颈部消毒后于正中偏右纵向切开皮肤，分离并暴露出右颈外静脉，并在其下穿入两根手术线备用，其中的一根线结扎血管远心端，然后用眼科剪一切口，沿此切口向心脏准确地插入导管，轻轻向前推进导管，参考生理记录仪上所显示的压力波形及压力值来判断导管口所到达的位置并做好记录，当出现典型的肺动脉压力波形时固定导管，记录PAP。同时，分离左侧颈总动脉，插管并检测SAP。

1.2.3右心肥厚指数(RVHI)测定 参考相关文献〔6〕，血流动力学指标测定结束后，取下大鼠心脏，剪去心房及大血管根部，沿后室壁间沟将心脏分离成右心室(RV)和左心室加室间隔(LV+S)两部分，吸干心肌表面水份，精确称量RV和LV+S两部分的重量。RVHI=〔RV/(LV + S)〕×100%。

1.2.4IL-6、TNF-α和MCP-1含量测定 上述血流动力学指标测定结束后，腹主动脉取血，静置后离心，取上层血清分装后，-70℃冷冻备用。ELISA试剂盒测定炎性因子IL-6、TNF-α和MCP-1含量，具体参照试剂盒说明书操作。

1.2.5肺组织取材及病理检查 取出大鼠左侧肺叶，置于10%的甲醛中固定3～5 d，进行石蜡包埋并切片，进行HE 染色。显微镜观察肺组织形态学变化，分析炎性细胞的浸润情况。同时利用图像分析系统测定直径小于200 μm的肺小动脉管壁厚度(WT)、肺小动脉外径(ED)、管腔面积(VA)和血管总面积(TVA)，从每只大鼠中选取一张肺组织切片，每张切片连续观察10条直径<200 μm的肺小动脉，分析并测定上述指标。然后分别计算管壁厚度与血管外径比值(WT%)、管腔面积与血管总面积比值(VA%)，WT%=WT/ED×100%，VA%=VA/TVA×100%。

1.3统计学方法 采用Adobe photoshop CS进行图像处理，SPSS15.0、Origin7.5软件进行单因素方差分析，Dunnet-t检验。

2 结 果

2.1各组一般状况及死亡情况 对照组大鼠皮毛顺滑，动作敏捷，饮食正常。模型组大鼠体力虚弱，反应较为迟钝，大多蜷缩少动，皮毛暗淡无光泽，出现呼吸困难症状。法舒地尔组治疗1 w后活动量较模型组增加，呼吸困难症状缓解。实验动物死亡情况：本实验共死亡5只大鼠，模型组3只大鼠分别死于实验第15，18和24天，治疗组2只死亡，分别死于第18和24天，大鼠死亡前均表现为呼吸困难、口鼻发绀。

2.2各组体重变化 对照组大鼠体重稳步增长，与第1天相比，第10～28天体重均明显增加(P<0.01)，模型组大鼠在注射MCT后体重无明显增加，法舒地尔组大鼠体重在第20～28体重明显增加(P<0.01)。见表1。

2.3各组血流动力学指标及RVHI变化 与对照组相比，模型组PAP和RVHI均明显升高(P<0.01)，而法舒地尔组PAP和RVHI均较模型组明显降低(P<0.05)。各组SAP差异无统计学意义(P>0.05)。见表2。

2.4各组炎性因子IL-6、TNF-α和MCP-1水平比较 与对照组相比，模型组血清炎性因子IL-6、TNF-α和MCP-1含量均显著升高(P<0.01)。而法舒地尔治疗组不同程度降低了上述炎性因子的表达(P<0.05或P<0.01)。见表3。

表1 各组体重变化

与本组内第1天比较：1)P<0.01

表2 各组血流动力学指标及RVHI变化

与对照组比较：1)P<0.01，与模型组比较：2)P<0.05

表3 各组炎性因子水平比较

与对照组比较：1)P<0.01，与模型组比较：2)P<0.05,3)P<0.01

2.5各组光镜下肺组织炎性情况观察 对照组肺组织中炎性细胞数相对较少；模型组肺组织及肺小血管周围出现大面积炎性细胞浸润，有淋巴细胞及少量单核细胞和中性粒细胞聚集；而法舒地尔组肺组织中可见各类炎性细胞浸润现象明显减轻。见图1。

图1 各组肺组织炎性情况观察(HE，×100)

2.6各组光镜下肺小动脉形态学观察和构型重建分析 肺组织HE染色结果显示：对照组大鼠肺小血管内表面光滑，内皮细胞连续排列，细胞均匀分布，肺小动脉管壁较薄，管腔较大；而模型组大鼠肺小动脉内皮细胞破坏严重，呈现断续排列，并呈突向血管腔内，管壁厚度显著增加，管腔面积明显变小；法舒地尔组大鼠肺小动脉内皮细胞连续性有所好转，管壁厚度较模型组明显缩小，管腔面积明显扩大，见图2。与对照组相比，模型组大鼠肺小动脉WT%明显增加(P<0.01)，而VA%显著降低(P<0.01)，说明出现了明显肺血管构型重建；而法舒地尔干预后肺小动脉WT%明显下降(P<0.05)，VA%显著增加(P<0.01)，说明法舒地尔明显抑制了肺血管构型重建。

图2 各组肺组织病理学观察(HE，×100)

3 讨 论

本实验结果与文献报道〔7〕的结果一致，证实MCT能够作用于肺动脉系统，诱导肺小动脉内皮损伤，引起炎性细胞浸润，平滑肌细胞增殖、肥大等一系列病理改变，形成“炎症性” PAH。

Rho激酶通过抑制肌球蛋白轻链磷酸化导致肺动脉平滑肌收缩，其过度激活可造成肺血管强烈收缩，因此，Rho激酶异常活化是PAH发生的重要因素之一〔8〕。新兴PAH研究靶点通过抑制Rho激酶途径发挥舒张肺血管的作用而有益于PAH的治疗，但具体机制可能远非如此，也就是说，抑制Rho激酶后还可能会通过发挥其他方面的作用而益于PAH的治疗。新型异喹啉磺胺衍生物法舒地尔，通过抑制Rho激酶活性阻断肌球蛋白轻链磷酸化，起到舒张血管，降低血管阻力的作用，目前广泛用于改善及预防蛛网膜下腔出血术后的脑血管痉挛及脑缺血症状。随着Rho/ROCK信号通路在PAH发生发展中的研究深入，该药有望成为预防和治疗PAH的选择药物之一。本研究显示法舒地尔能明显降低PAH大鼠平均PAP 和RVHI，而SAP无明显变化，与此相一致，Fujita 等〔9〕进行的小样本临床研究还表明法舒地尔能降低平均PAP以及肺血管阻力，说明法舒地尔在降低PAH患者肺血管阻力的同时不明显影响体循环状况，安全性较好，同时也说明其作用可能也不仅限于血管扩张作用。

鉴于炎症参与肺血管重构，在PAH形成中起关键作用，而Rho/ROCK通路的异常活跃也促进了炎症反应的发生，在炎症的多个环节都发挥重要作用〔10〕，故

有理由推测Rho/ROCK通路可能参与了PAH发生发展过程中的炎性改变。而作为Rho激酶抑制剂的法舒地尔也可能会发挥一定的抗炎作用，而这必将有益于PAH的治疗，也为该药的临床新用途提供基础试验资料。本研究显示，模型组炎性因子含量均明显增高，而法舒地尔明显降低上述炎性因子表达，且能明显抑制PAH大鼠的炎症反应，而这可能与其改善MCT诱导的PAH损伤有关。

目前认为，PAH形成的关键在于肺血管重构，因此如何阻止及逆转肺血管重构是治疗PAH的关键环节〔11〕。本研究显示，法舒地尔能明显抑制MCT诱导PAH大鼠炎症反应的发生，这可能是其改善PAH大鼠肺血管重建的重要机制。

4 参考文献

1Joppa P,Petrasova D,Stancak B,etal.Systemic inflammation in patients with COPD and pulmonary hypertension〔J〕.Chest,2006;130:326-33.

2Price LC,Wort SJ,Perros F,etal.Inflammation in pulmonary arterial hypertension〔J〕.Chest,2012;141:210-21.

3Guilluy C,Eddahibi S,Agard C,etal.RhoA and Rho kinase activation in human pulmonary hypertension:role of 5-HT signaling〔J〕.Am J Res Crit Care Med,2009;179(12):1151-8.

4Schaafsma D,Gosens R,Zaagsma J,etal.Rho kinase inhibitors:a novel therapeutical intervention in asthma〔J〕?Eur J Pharmacol,2008;585(2-3):398-406.

5章新华，陈 磊，王怀良，等.大鼠肺动脉压检测方法研究〔J〕.中国医科大学学报，2004；33(5)：388-9.

6吴苏玲，毕立清，孔 辉，等.鲁斯可皂苷元对野百合碱诱导的肺动脉高压大鼠炎症反应的影响〔J〕.中国药理学通报，2013;29(6)：823-7.

7Tofovic SP,Salah EM,Mady HH,etal.Estradiol metabolites attenuate monocrotaline-induced pulmonary hypertension in rats〔J〕.J Cardiovasc Pharmacol,2005;46(4):430-7.

8Fukumoto Y.Role of the Rho-kinase pathway in pulmonary arterial hypertension〔J〕.Nihon Yakurigaku Zasshi,2014;143(4):178-81.

9Fujita H,Fukumoto Y,Saji K,etal.Acute vasodilator effects of inhaled fasudil,a specific Rho-kinase inhibitor，in patients with pulmonary arterial hypertension〔J〕.Heart Vessels,2010;25(2):144-9.

10Nozaki Y,Kinoshita K,Hino S,etal.Signaling Rho-kinase mediates inflammation and apoptosis in T cells and renal tubules in cisplatin nephrotoxicity〔J〕.Am J Physiol Renal Physiol,2015;308(8):F899-909.

11Lee SH,Rubin LJ.Current treatment strategies for pulmonary arterial hypertension〔J〕.J Intern Med,2005;258(3):199-215.