宣痹通瘀方对急性冠脉缺血大鼠血管新生作用的影响

李双娣 成光宇 刘迎辉 隋永朋 李洪禹 刘爱东

(长春中医药大学附属医院，吉林 长春 130021)

研究发现〔1～4〕，Notch信号通路在促进心肌再生、改善心肌缺血、诱导血管新生的过程中发挥作用，对损伤心肌发挥一定修复作用。本文主要观察宣痹通瘀方对心肌缺血大鼠Notch通路的干预作用及血管新生的影响。

1 材料与方法

1.1实验动物 110只清洁级SD大鼠，雌雄各半，重量220～250 g，由辽宁长生生物技术有限公司提供，动物合格证号：SCXK(辽)2015-0001。室内温度(23±3)℃、室内相对湿度65%～70%，自然光线照明，普通饲料喂养，自由饮水。

1.2主要药物和试剂 宣痹通瘀胶囊成分包括延胡索(酒炙)、三七、川芎、郁金、人参、冰片，由长春中医药大学附属医院新药研发中心提供；阳性对照药麝香保心丸，由上海和黄药业有限公司生产(国药准字231020068)，规格:22.5 mg/每丸；单硝酸异山梨酯片20 mg/片，鲁南制药。跨膜受体蛋白Notch抗体：规格：1 ml/瓶，产品批号：JL0972R，美国Sigma公司产品；兔免疫球蛋白(Ig)G-免疫组化试剂盒(SABC即用型)：产品批号：11H24J20，武汉博士徳生物工程有限公司产品。

1.3仪器设备 医学图像分析系统，型号：JEDR 801D，江苏省捷达科技发展有限公司产品；倒置显微镜，型号：Nikon1671-HA，日本Nikon公司。生理信号采集系统，型号:Powerlab/8sp，澳大利亚埃德公司产品。医学图像分析仪，型号:BI-2000型，成都泰盟股份有限公司产品。全自动生化分析仪，型号:Selectra Junior，荷兰威图科学仪器公司产品。酶标仪，型号:BIOO680，美国伯乐公司产品。台式高速低温离心机，德国贺利氏公司产品。电子天平，型号:SQP，规格:PRACTUM313-1CN，序列号:0028892121。赛多利斯科学仪器(北京)有限公司产品。

1.4方法

1.4.1模型制备、分组、给药 大鼠分笼饲养、稳定、适应环境1 w。实验前，应用心电图机对受试动物进行单导联(Ⅱ导联)检测，筛选出心电图正常的大鼠用于实验(共108只)。采用快速开胸结扎冠状动脉前降支方法制备急性心肌缺血动物模型〔5〕。具体方法如下：将大鼠置于密闭容器中，使其被迫吸入乙醚，进入浅麻醉状态。将大鼠仰位固定于鼠板上，去除胸部的毛，碘伏局部消毒，在第4～5肋间开胸，钝性分离肌层，打开胸腔，拉钩扩胸，暴露心脏，在左心耳根部与肺动脉圆锥交界处，相当于左冠状动脉起始处下2 mm穿一手术线结扎，迅速将心脏送回胸腔，排出进入胸腔的气体及血液，缝合胸壁。再次用碘伏络合碘消毒液进行皮肤表面消毒，并在腹腔注射适量青霉素，待动物苏醒后，放入笼中常规饲养。造模5 min后，将所有结扎大鼠进行心电图监测，运用Powerlab/8s型八导数据分析记录仪描记一段Ⅱ导联心电图，与造模前每只大鼠观测的心电图相比较，观察ST段偏移幅度，以ST段较前抬高0.2 mV定为造模成功。将造模成功的大鼠随机分为：模型组(n=16)；麝香保心丸组(n=15)：给予麝香保心丸24.3 mg·kg-1·d-1；单硝酸异山梨酯组(n=15)：给予单硝酸异山梨酯7.2 mg·kg-1·d-1，低、中、高剂量组(各n=15)：分别给予宣痹通瘀方0.8、1.6、3.2 g·d-1·kg-1，假手术组(n=15)：大鼠的操作方法同模型组，只穿线不结扎。不同剂量组给予不同浓度、相同体积的方法，灌胃体积均为10 ml·kg-1·次-1。术后次日开始给药，灌胃给药1次/d，连续给药4 w。每天灌胃后1 h进行心电图检测。

1.4.2指标检测

1.4.2.1各组大鼠血清指标检测 梯度融化-80℃保存的各组血清，按试剂盒说明书要求测量血清肌钙蛋白(cTn)I含量。

1.4.2.2各组大鼠心电图ST段改变、心肌梗死面积对比 造模后第4周末将大鼠心肌经氯化硝基四氮唑蓝(NBT)染色，通过形态学图像分析系统计算出心肌梗死面积占心肌总面积的百分比。

1.4.2.3免疫组织化学法测定 取心肌组织切片，按照试剂盒流程对各组大鼠心肌组织进行Notch1指标检测。光学显微镜下观察、拍照。

1.5统计学方法 采用SPSS19.0软件进行单因素方差分析(One-way ANOVA)。

2 结 果

2.1造模前后各组大鼠一般状态比较 模型组大鼠精神萎靡，进食差，实验结束后模型组大鼠死亡6只，其余各组大鼠精神状态逐渐好转，活动逐渐灵活自如，进食饮水正常，其中麝香保心丸组、单硝酸异山梨酯组大鼠死亡4只，高剂量组死亡2只，中、低剂量组各死亡4只、5只。

2.2各组大鼠心肌梗死面积及cTnI含量比较 假手术组心肌切片未形成梗死区域；麝香保心丸组、单硝酸异山梨酯组、高、中剂量组心肌梗死面积均明显低于模型组(P<0.01，P<0.05)；低剂量组心肌梗死面积与模型组比较有减小趋势,但差异无统计学意义(P>0.05)。模型组cTnI含量显著高于假手术组(P<0.001)；麝香保心丸组、单硝酸异山梨酯组，高、中、低剂量组cTnI含量显著低于模型组(P<0.05,P<0.01)。见表1。

2.3各组大鼠心电图ST段比较 冠状动脉结扎前，各组心电图ST段均在正常值范围，差异无统计学意义(P>0.05)。冠状动脉结扎后5 min、给药第1～7天与假手术组比较，模型组各心电图ST段均明显抬高(P<0.001，P<0.01，P<0.05)。给药第2～7天，高剂量组心电图ST段上移幅度均明显低于模型组(P<0.01，P<0.05)；给药第3～6天，中剂量组心电图ST段上移幅度均明显低于模型组(P<0.05，P<0.01)；给药第3～5天低剂量组心电图ST段上移幅度明显低于模型组(P<0.05)。给药第2～5天，麝香保心丸组、单硝酸异山梨酯组心电图ST段上移幅度均明显低于模型组(P<0.05)。见表2。

2.4各组心肌Notch1阳性表达染色面积及平均光密度比较 与假手术组比较，模型组Notch1阳性表达染色面积及平均光密度表达均显著上升(P<0.001)；与模型组比较，麝香保心丸组、单硝酸异山梨酯组、低剂量组Notch1阳性表达染色面积及平均光密度表达均有下降趋势，但差异无统计学意义(P>0.05)；高、中剂量组Notch1阳性表达染色面积及平均光密度表达均显著下降(P<0.01,P<0.05)。与单硝酸异山梨酯组比较，高、中剂量组Notch1阳性表达染色面积及平均光密度表达均显著下降(P<0.01,P<0.05)。见表3。

表1 各组大鼠心肌梗死面积及cTnI含量比较

与模型组比较：1)P<0.05；2)P<0.01；3)P<0.001，下表同

表2 各组不同时间点标准Ⅱ导联心电图ST段变化比较

表3 各组Notch1阳性表达染色面积及平均光密度表达比较

与模型组比较 : 1)P<0.05，2)P<0.01，3)P<0.001;与单硝酸异山梨酯组比较:4)P<0.05，5)P<0.01

3 讨 论

冠心病的病理基础是冠脉粥样硬化斑块形成，造成管腔狭窄，使血流受阻，导致心肌缺血。冠心病的发病诱因有情绪激动、过劳、饱餐、寒冷等，其中因情绪激动诱发心绞痛的情况最为常见，西医理论认为：情绪激动导致交感神经兴奋，刺激冠脉血管痉挛收缩，引发心肌缺血，出现胸闷痛症状。中医上冠心病属于“胸痹”“心痛”“厥心痛”等范畴，对冠心病心绞痛的病因认识，中医理论认为，情志不遂，肝失疏泄调达，气机升降出入失常，气行不畅，气为血之帅，气行则血行，气滞则血停，血行不畅，瘀滞不通，不通则痛发为胸痹心痛。中西医在各自理论的指导下，建立了独立的治疗方案。

本实验模型组肌丝束溶解、断裂，肌丝排列略松散、不整齐，提示急性心肌缺血大鼠模型制作成功。心电图ST段改变是通过心脏电活动反应心肌缺血的一项评价指标，单硝酸异山梨酯作为治疗冠心病的经典用药，对急性心肌缺血心电图ST段的干预作用是毋庸置疑的。本研究表明，宣痹通瘀方、麝香保心丸及单硝酸异山梨酯均有有改善心肌缺血及减少心肌梗死面积的作用。

在哺乳动物体内，目前发现Notch的4种受体和5种配体分别是Notch1、2、3、4及Delta like1、3、4和Jagged1、2〔6〕，其中受体Notch1、Notch4与配体Dell4主要在血管内皮细胞中表达，并在塑造血管的过程中发挥功能〔7〕。本实验提示宣痹通瘀方可以通过调节Notch含量来发挥改善心肌缺血的作用，宣痹通瘀高、中、低剂量组干预Notch1的作用明显强于单硝酸异山梨酯组，考虑与中药发挥益气化瘀、理气通络作用相关。

综上，宣痹通瘀方和麝香保心丸能改善气滞血瘀型急性心肌缺血大鼠的心肌梗死面积、心电图ST-T改变，对心肌缺血有改善，其机制可能是宣痹通瘀方中重用活血化瘀、益气通络的药物，能祛瘀生新，从而达到上调Notch的作用，进而促进血管新生而发挥改善心肌缺血的作用。

4 参考文献

1Murphy E,Steenbergen C.Ion transport and energetics during cell death and protection〔J〕.Physiology(Bethesda),2008;23:115-23.

2Piper HM,Abdallah Y,Schafer C.The first minutes of reperfusion:a window of opportunity for cardioprotection〔J〕.Cardiovasc Res,2004;61(3):365-71.

3Varadarajan SG,An J,Novalija E,etal.Changes in 〔Na(+)〕(i),compartmental〔Ca(2+)〕,and NADH with dysfunction after global ischemia in intact hearts〔J〕.Am J Physiol Heart Circ Physiol,2001;280(1):H280-93.

4Tanno M,Miura T.Protecting ischemic hearts by modulation of SR calcium handling〔J〕.Cardiovasc Res,2007;75(3):453-4.

5王 旺，吴晓华，黄 文.结扎大鼠左冠状动脉前降支造成心肌缺血模型的实验研究〔J〕.现代预防医学,2011;38(10):1899-900.

6Xie J,Wang W,Si JW,etal.Notch singnaling regulates CXCR4 expression and the migration of mesenchymal stem cell 〔J〕.Cell Immunol,2013;281(1):68-75.

7Kume T.Ligand-dependent Notch signaling in vascular formation 〔J〕.Adv Exp Med Biol,2012;727:210-22.