参附注射液对老年急性失血再灌注大鼠脑水通道蛋白-4的影响

曾建华 陈丹慧 王 碧 刘 旺

(贵阳中医学院第二附属医院麻醉科，贵州 贵阳 550003)

参附注射液是由中医治疗厥脱证(休克)古验方参附汤加工提炼而成，为红参、黑附片的提取物。具有益气温阳的功效有多重药学作用。参附注射液对缺血再灌注组织具有保护作用〔1〕。脑缺血可引起血脑屏障功能障碍，进而造成脑水肿，在脑细胞水调节代谢中水通道蛋白(AQP)-4起着重要作用。本文拟观察参附注射液对老年大鼠急性缺血再灌注脑组织中AQP-4的影响，探讨参附注射液是否有脑保护作用。

1 材料和方法

1.1动物及分组 选取16～19月龄SD大鼠70只〔SPF级，雌雄各半，体质量(250±20)g，购自长沙市天勤生物有限公司〕。随机分为8组。A组：假手术组；B组：放血组；C组：5%葡萄糖氯化钠组；D组：5%葡萄糖生理盐水加参附注射液组；E组：胶体组(6%羟乙基淀粉溶液)；F组：参附注射液加胶体组；G组：血液组；H组：血液加参附注射液组。每组7只。剔除因饲养原因死亡的大鼠9只，因造模失败的大鼠5只。

1.2试剂及设备 5%葡萄糖生理盐水；6%羟乙基淀粉溶液(北京费森尤斯卡比医药有限公司)；参附注射液(雅安三九制药有限公司)；肝素；肝素抗凝管；10%水合氯醛；AQP-4购自上海蓝基生物技术有限公司(生产批号：20131209)；UV2501PC型紫外分光光度计(日本岛津分类号：03040426)；HHW-420三用数显恒温水浴箱(金伝亿通电子有限公司)；TP-213电子天平(北京赛多利斯仪器系统有限公司)；MULTISKAN GO酶标仪(Thermo Fisher科技公司)；LEGEND MICRO ZIR离心机(Thermo Fisher科技公司)；MULTIFUGE X1R离心机(Thermo SCIENTIFIC)；漩涡混匀器、微量移液器等。

1.3失血模型的建立 术前禁食、禁饮6 h，腹腔注射10%水合氯醛溶液(10 ml/kg),麻醉下行气管切开术，与小动物呼吸机连接，行机械通气,维持呼气末二氧化碳分压为30～40 mmHg。剥离左颈静脉和右颈总动脉，经颈浅静脉以1 ml/kg剂量注射1%肝素钠全身抗凝后行动、静脉插管、备输液及放血。颈总动脉插管为三通管，连接生物信号采集系统，连续记录各组平均动脉压(MAP)。稳定15 min后，模型组匀速放血至MAP为40 mmHg(5.3 kPa)左右(35～45 mmHg)，放血时间为5 min，维持低血压60 min，复制失血性休克模型。假手术组不进行放血处理。

1.4试验方法 失血性休克模型动物在维持低血压60 min后，经由颈静脉缓慢进行全血及液体复苏，输液速度为0.5 ml/min，输液时间为20 min左右。其中，C组推注5%葡萄糖氯化钠溶液(2 ml/kg)、D组推注参附溶液(参附注射液1 ml/kg，加入等量的5%葡萄糖氯化钠溶液稀释至2 ml/kg)、E组推注羟乙基淀粉溶液(2 ml/kg)、F组推注参附溶液(1 ml/kg，以羟乙基淀粉溶液稀释至2 ml/kg)、G组推注该动物的血液、H组推注参附溶液(1 ml/kg，预先混入血液中)，补液量与放血量相等(或补液量以MAP为标准，当MAP恢复至放血前的水平即停止输液)；A组不放血、不输液，仅实施手术；B组放血、不输液；观察2 h。

1.5检测指标 ①大脑组织含水量：2 h后迅速处死大鼠，取左侧大脑精密称定湿质量，置于60℃恒温烘箱48 h后再精密称定干质量。计算脑组织含水量公式如下：脑组织含水量=(湿质量-干质量)/湿质量×100%；②脑组织AQP-4的表达 处死大鼠，取右侧大脑，加入生理盐水适量制成20%脑组织匀浆备用，照试剂盒说明书进行。

1.6统计学分析 采用SPSS17.0软件进行方差分析及t检验。

2 结 果

2.1各组大脑组织含水量的比较 D、F、G、H组脑湿重显著低于B组(P<0.05，P<0.01)；D、H组脑湿重显著低于C组(P<0.05)；E组脑湿重显著高于D组(P<0.05)；G组脑湿重显著低于E组(P<0.05)。D、F、G、H组脑干重显著低于B组(P<0.05)；D组脑干重显著低于C组(P<0.05)。见表1。

表1 各组大脑组织含水量及AQP-4表达比较

与A组比较：1)P<0.05，2)P<0.01；与B组比较：3)P<0.05，4)P<0.01；与C组比较：5)P<0.05,6)P<0.01；与D组比较：7)P<0.05；与E组比较：8)P<0.05

2.2各组脑组织AQP-4表达比较 B、C、D、E、F、G、H组AQP-4表达均显著高于A组(P<0.05，P<0.01)；C、E组AQP-4的表达显著高于B组(P<0.01)；D组AQP-4的表达显著低于C组(P<0.01)。见表1。

3 讨 论

急性大量失血后体循环容量减少，可使全脑血流量减少，脑灌注压下降；同时，急性贫血可导致血液系统携氧能力降低，使局部组织缺氧〔2〕，脑血流减少，可引发选择性的神经细胞损伤；而脑缺血后再灌注早期会发生血脑屏障转运系统变化，导致血脑屏障急性或严重的慢性渗透性的改变，引起脑水肿〔3〕。虽然对于脑水肿发生的机制尚存在众多争议，但大量的研究认为，AQP-4对于脑水肿的发生和消退有重要作用。AQP-4在脑内主要表达于室管膜细胞、星形胶质细胞、软脑膜、脉络丛、室旁核和下丘的视上核，具有选择性转运水的功能〔4，5〕，但AQP-4在脑缺血后再灌注引起的脑水肿周围组织中表达的时间窗问题上尚无定论。因此，中药针对缺血后再灌注损伤治疗时机的把握也存在争议。参附注射液对脑缺血再灌注组织具有保护作用，其可能的机制是扩张血管和改善脑内血流〔6〕。

从本研究可以看出，失血性休克早期即可触发AQP-4表达，而早期应用参附注射液可以改善脑内血流，抑制AQP-4 的表达。由此可以推论AQP-4在失血性休克早期的高表达，可能起到维持脑内水平衡的作用，而不是单纯地加重脑水肿。而参附注射液可能是通过抑制AQP-4表达，以改善脑血流的作用。综上，急性失血后再灌注早期应用参附注射液可降低AQP-4的表达，改善脑血流，但是AQP-4在急性失血后的高表达是否可促进脑水肿发生，参附注射液抑制AQP-4的表达是否可改善失血后再灌注损伤的预后，还有待研究。

4参考资料

1谢 健，闵 苏.参附注射液对缺血再灌注损伤保护作用的研究进展〔J〕.重庆医药，2006;35(2)：2099-100.

2吕一冬，刘秀珍，王宏月,等.大量失血对老年大鼠空间学习记忆能力的影响〔J〕.重庆医药，2015;44(1)：158-61.

3庄心良，曾因明，陈伯銮.现代麻醉学〔M〕.第3版，北京：人民卫生出版社，2004：28-33.

4夏文政，胡韶山.水通道蛋白4与脑水肿研究进展〔J〕.现代生物医学进展，2015;15(4)：768-70.

5任非非，刘敬霞.中医药调控水通道蛋白4保护脑缺血再灌注损伤的研究进展〔J〕.中国老年学杂志，2015;35(4)：1990-3.

6薛 丽，丁小英，张红莉,等.参附注射液对大鼠脑缺血再灌注损伤保护作用的研究〔J〕.山东医药，2004;44(22)：20-1.