干扰PDK1表达对血管瘤细胞增殖、凋亡及PI3K/Akt信号通路的影响

陈德才 王 雅 马从乾 杨 轲 陈 辉

(南阳市中心医院血管外科，河南 南阳 473200)

血管瘤是皮肤肿瘤中常见的良性肿瘤，在我国的发病率为5%～10%〔1〕。既往研究证明，血管内皮细胞和血管生成与血管瘤的发生发展有密切关系〔2〕。血管内皮细胞增殖过度和血管生长过快是血管瘤主要的生物学特征〔3〕。目前，血管瘤的分子和细胞学发病机制仍然不清楚，普遍认为由增生期、消退期、消退完成期组成，其中血管瘤细胞的增殖与凋亡对血管瘤的演进具有重要作用〔4〕。因此，血管瘤细胞的增殖、凋亡机制成为研究的热点之一。3-磷酸肌醇依赖性激酶(PDK)1对细胞的增殖、凋亡具有重要的调节作用〔5〕。因此，本实验通过siRNA特异性抑制小鼠血管内皮细胞瘤细胞EOMA中PDK1表达，研究其表达量下降对内皮细胞增殖、凋亡的影响及作用机制。

1 材料与方法

1.1实验主要材料 小鼠血管内皮细胞瘤细胞系EOMA购自美国模式菌种收集中心(ATCC)，胎牛血清(FBS)购自美国Gibco公司，DMEM购自美国Hyclone公司，噻唑蓝(MTT)试剂盒购自美国Amresco公司，Annexin V-FITC凋亡试剂盒购自德国Miltenyi Biotec公司，活化的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(酶切Caspase)-3抗体、蛋白激酶B(Akt)抗体、磷酸化(p)-Akt抗体、β肌动蛋白(actin)抗体、辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗兔二抗均购自美国Cell Signaling公司。

1.2细胞的培养 EOMA细胞置于T25培养瓶中，加入5 ml含10% FBS、青霉素、氯霉素的新鲜DMEM培养基，置于37℃，5% CO2的细胞培养箱中培养过夜，待细胞汇合度达到80%左右更换培养基继续培养，0.25%胰酶消化细胞，每隔2～3 d按1∶3的比例进行传代。

1.3细胞转染 细胞转染前24 h，将EOMA细胞接种于6孔板上，每孔2×106个细胞，放置在细胞培养箱中培养至细胞汇合度达到80%～90%时，在Lipofectamine 2000转染试剂说明的指导下进行转染，实验分3组：siRNA-PDK1组中加入siRNA-PDK1、Lipofectamine 2000，siRNA-NC组中加入 siRNA-NC、 Lipofectamine 2000，对照组加入等量的培养基和 Lipofectamine 2000，轻轻混匀后室温孵育15 min，置于培养箱中培养48 h，免疫印迹试验检测转染效果。

1.4MTT法检测细胞增殖活力 取生长状态良好的对数期细胞，0.25%胰酶消化成单细胞悬液，分别接种到96孔板上，每孔1×106个细胞，每组5个复孔，37℃，5%CO2细胞培养箱中培养48 h，加入20 μl/孔MTT溶液，避光孵育4 h，取出培养板，每孔加入150 μl二甲基亚砜，充分振荡，在酶标仪490 nm波长下检测每孔的光密度值(OD值)，计算细胞增殖活力。

1.5流式细胞术检测细胞凋亡率 取对数期细胞，将细胞浓度调整为1×106个/ml，分为三组分别接种在6孔板上，转染后置于培养箱中培养48 h，收集细胞至10 ml流式离心管内，加入10 μl Annexin V-FITC，充分混匀，4℃避光反应30 min，加入10 μl PI，振动混匀，采用流式细胞仪测定各组细胞凋亡情况，重复3次。

1.6免疫印迹试验检测细胞中Akt、p-Akt、酶切Caspase-3蛋白表达量 弃去上清，收集细胞，加入RIPA细胞裂解液，置于冰上反应10 min，离心，收集上清，BCA法检测蛋白浓度。加入SDS缓冲液调整蛋白浓度，100℃煮沸变性5 min，配制10%的分离胶和5%浓缩胶，取50 μg蛋白质加入上样孔，120 V电泳至溴酚蓝迁移至凝胶底部，取出凝胶，切除多余凝胶，转移至硝酸纤维素膜上，置于5%脱脂奶粉室温封闭1 h，加入一抗稀释液，4℃孵育过夜，TBST清洗3次，每次5 min，加入HRP标记羊抗兔二抗，室温孵育1 h，TBST洗涤3次，每次5 min，滴加化学发光试剂，用凝胶成像仪扫描，目的蛋白灰度值/β-actin灰度值表示蛋白表达水平，实验重复3次。

1.7统计学分析 采用SPSS21.0软件行方差分析。

2 结 果

2.1免疫印迹试验检测细胞的转染效果 与对照组(0.852±0.063)相比，siRNA-NC组细胞中PDK1蛋白的表达量(0.838±0.539)差异无统计学意义(P>0.05)，siRNA-PDK1组细胞中PDK1蛋白的表达量(0.462±0.033)显著降低(P<0.05)。见图1。

2.2干扰PDK1表达对细胞增殖活性的影响 siRNA-NC组细胞增殖活性〔(99.489±0.055)%〕与对照组〔(100.232±0.054)%〕相比差异无统计学意义(P>0.05)，siRNA-PDK1组细胞活力〔(76.528±5.662)%〕显著低于对照组(P<0.05)。

2.3干扰PDK1表达对细胞凋亡率的影响 与对照组〔(9.487±1.052)%〕相比，siRNA-NC组细胞凋亡率〔(10.523±1.456)%〕差异无统计学意义(P>0.05)，siRNA-PDK1组细胞凋亡率〔(27.489±5.759)%〕显著升高(P<0.05)。

2.4干扰PDK1表达对细胞中Akt、p-Akt、酶切Caspase-3蛋白表达量的影响 与对照组相比，siRNA-NC组细胞中Akt、p-Akt、酶切Caspase-3蛋白表达量差异无统计学意义(P>0.05)，siRNA-PDK1组细胞中Akt蛋白表达量差异无统计学意义(P>0.05)，p-Akt蛋白表达量显著降低(P<0.05)，酶切Caspase-3蛋白表达显著增加(P<0.05)。见图2，表1。

图1 转染后细胞中PDK1蛋白表达

图2 沉默PDK1的表达对细胞中Akt、p-Akt、 酶切Caspase-3蛋白的表达量的影响

组别Aktp-Akt酶切Caspase-3对照组0.855±0.0690.578±0.0650.445±0.068siRNA-NC组0.862±0.0730.564±0.0630.421±0.062siRNA-PDK1组0.860±0.0790.356±0.0241)0.635±0.0521)

与对照组相比：1)P<0.05

3 讨 论

皮肤血管瘤是一种常见的良性肿瘤，其组织学特点为内皮细胞过度增殖〔6〕。血管瘤可产生于身体的多个部位，以皮肤和皮下组织中较常见，常采用激光、放射、激素、干扰素等多种治疗方法，其中以手术治疗效果较好〔7〕。但血管瘤若长在眼、耳、鼻等重要器官的特殊部位，很难以手术治疗进行根除，因此较多采用非手术的方式。目前，临床上采用的非手术方式中较多的是激素治疗，长期使用的负效应较大〔8〕，所以亟需寻找一种新的非手术治疗方法。PDK1属于丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶家族的成员之一，分子量为63 kD，含有PH结构域，与4，5-二磷酸化磷酸肌醇、3，4-二磷酸化磷酸肌醇和3，4，5-三磷酸化磷酸肌醇等磷酸肌醇类化合物有很强的分子亲和力，是细胞中很多重要信号通路的关键因子〔9〕。研究表明PDK1在人体的多种组织中均表达，对肿瘤细胞的增殖、凋亡、上皮细胞间质转化过程等发挥重要作用〔10〕。本实验结果表明PDK1参与血管瘤细胞的增殖、凋亡的过程。

磷脂酰肌醇-3激酶(PI3K)/Akt参与肿瘤细胞过度增殖、血管生长、放化疗的保护作用，对维持血管瘤生物学特征具有重要的调节作用〔11〕。当机体受到外界刺激，产生多种细胞因子，诱导激活PI3K磷酸化，促进第二信使3，4，5-三磷酸化磷脂酰肌醇的产生，第二信使可与具有PH结构域的蛋白如PDK1、Akt结合，从而促进Akt磷酸化，激活或抑制下游通路靶基因表达，发挥调控细胞增殖、凋亡的作用〔12，13〕。PDK1是Akt的上游基因，对PI3K/Akt信号通路及下游靶基因Caspase-3的活性均具有重要的调节作用〔14〕。PDK1可通过PI3K/Akt信号通路调节细胞一系列的生物学作用如增殖、凋亡、分化、周期等。研究〔15，16〕表明PDK1介导的PI3K/Akt信号通路与肿瘤的发生发展密切相关，如乳腺癌、胰腺癌、血管瘤等，且PDK1在这些肿瘤组织中都是高表达。提示PDK1在血管瘤中可能通过影响PI3K/Akt信号通路的激活进而促使酶切Caspase-3高表达，从而调控细胞的增殖、凋亡过程。

综上所述，沉默PDK1的表达可抑制血管瘤内皮细胞增殖，诱导其凋亡，作用机制可能与PI3K/Akt信号通路介导的下游靶基因的表达有关，为血管瘤治疗方法的创新提供了理论基础。

4 参考文献

1曹 江，俞 松，吕 欣.重组人血管内皮抑素对体外培养血管瘤内皮细胞增殖，细胞周期及 VEGF，KDR/FIK-1 表达的影响〔J〕.中国生化药物杂志，2015；35(6)：31-4.

2Boscolo E，Mulliken JB，Bischoff J.Pericytes from infantile hemangioma display proangiogenic properties and dysregulated angiopoietin-1〔J〕.Arterioscler Thromb Vasc Biol，2013；33(3)：501-9.

3Biswas A，Pan X，Meyer M，etal.Urinary Excretion of MicroRNA-126 is a biomarker for hemangioma proliferation〔J〕.Plast Reconstr Surg，2017；139(6)：1277e-84e.

4Zuccolo E，Bottino C，Diofano F，etal.Constitutive store-operated Ca2+entry leads to enhanced nitric oxide production and proliferation in infantile hemangioma-derived endothelial colony-forming cells〔J〕.Stem Cells Dev，2015；25(4)：301-19.

5Yu ZL，Wang JN，Wu XH，etal.Tanshinone ⅡA prevents rat basilar artery smooth muscle cells proliferation by inactivation of PDK1 during the development of hypertension〔J〕.J Cardiovasc Pharmacol Ther，2015；20(6)：563-71.

6Pan C，Wang Y，Qiu MK，etal.Knockdown of HMGB1 inhibits cell proliferation and induces apoptosis in hemangioma via downregulation of AKT pathway〔J〕.J Biol Regul Homeost Agents，2017；31(1)：41.

7Vivas-Colmenares GV，Bernabeu-Wittel J，Alonso-Arroyo V，etal.Effectiveness of propranolol in the treatment of infantile hemangioma beyond the proliferation phase〔J〕.Pediatr Dermatol，2015；32(3)：348-52.

8Angela FA，Manfroi G，Mesquita Filho PM，etal.Successful propranolol treatment of multiple infantile hemangiomas with predominant neuroaxial involvement：a case report〔J〕.Arq Bras Neurocir，2016；35(2)：169-73.

9Zheng N，Ding X，Sun A，etal.PDK1 activity regulates proliferation，invasion and growth of hemangiomas〔J〕.Cell Phys Biochem，2015；36(5)：1903-10.

10宋世铎，周 健，朱东明，等.PDK1在胰腺癌中的表达及其临床意义〔J〕.世界华人消化杂志，2012；20(27)：2632-7.

11杜小颖，丁威薇，陈 悦，等.IGF-1 通过 PI3K/AKT 信号通路促进牙髓细胞增殖及碱性磷酸酶活性的研究〔J〕.口腔医学研究，2017；33(5)：538-41.

12李沐涵，程海波，李 黎，等.没食子酸通过 PI3K/AKT 信号通路抑制胃癌 MGC-803 细胞侵袭性的研究〔J〕.中药新药与临床药理，2017；28(1)：23-7.

13Liu Y，Yang K，Sun X，etal.MiR-138 suppresses airway smooth muscle cell proliferation through the PI3K/AKT signaling pathway by targeting PDK1〔J〕.Exp Lung Res，2015；41(7)：363-9.

14Vander Broek R，Mohan S，Eytan DF，etal.The PI3K/Akt/mTOR axis in head and neck cancer：functions，aberrations，cross-talk，and therapies〔J〕.Oral Diseases，2015；21(7)：815-25.

15Guerrero-Zotano A，Mayer IA，Arteaga CL.PI3K/AKT/mTOR：role in breast cancer progression，drug resistance，and treatment〔J〕.Cancer Metastasis Rev，2016；35(4)：515-24.

16Eser S，Reiff N，Messer M，etal.Selective requirement of PI3K/PDK1 signaling for Kras oncogene-driven pancreatic cell plasticity and cancer〔J〕.Cancer Cell，2013；23(3)：406-20.