长期有氧运动对去卵巢大鼠骨组织中内源性硫化氢生成的影响

王 兵 石 琼

(西安工业大学体育学院，陕西 西安 710032)

目前世界卫生组织已经把骨质疏松列为中老年三大疾病之一，在常见病中该病的发生率居第7位〔1〕。目前骨质疏松的治疗途径多种多样，主要包括药物疗法及运动治疗等。虽然药物疗法的疗效比较显著，但由于存在潜在的副作用和患者心理上和经济上的压力等原因，多数患者无法坚持长期治疗。而运动疗法由于不存在副作用，往往被骨质疏松患者广泛接受并能长期坚持。临床和动物实验均发现有氧运动有助于延缓或减轻老年患者或相关模型动物的骨质疏松的发生进程〔2～4〕。然而其中相关的分子机制至今尚未被完全阐明。硫化氢(H2S)被视为一种污染大气的有毒气体；而最近研究发现H2S是继一氧化氮和一氧化碳之后的第三种气体信号分子。内源性H2S主要由3-巯基丙酮酸硫基转移酶、胱硫醚β合酶、胱硫醚γ分解酶催化合成〔5〕。研究显示H2S的合成减少可能参与了细胞和组织的老化过程，其中机制涉及氧化应激、SIRT1蛋白的激活、年龄相关基因Klotho的调节等〔6,7〕。本研究探讨长期有氧运动对去卵巢大鼠内源性H2S生成的影响。

1 资料与方法

1.1动物和试剂 12周龄雌性SD大鼠(上海斯莱克实验动物有限责任公司)，RIPA 裂解液、RT-PCR试剂盒(Roche罗氏生物试剂)，丙二醛(MDA)试剂盒(上海碧云天生物科技实验室)，封口膜(PARAFILM公司)。

1.2动物模型和有氧运动 成年雌性SD大鼠30只,随机分为3组,每组10只。假手术组只切除卵巢旁脂肪组织;其余20只切除卵巢,分为去卵巢组和运动组。上述大鼠试验期间在相同的实验条件下给予普通饲料。术后1 w后，开始运动治疗。自制大鼠用跑台，放置于电动跑步机上，倾斜角度10°，第1～2周，每天30 min，速度为8 m/min；第3～4周，每天45 min，速度为12 m/min；接下来的8 w，每天60 min，速度为20 m/min。假手术组和去卵巢组大鼠仅放置于跑台上，但不转动跑台，放置时间与运动组相同。

1.3骨密度(BMD)和骨矿物质含量及生物力学指标检测 处死大鼠，剥离左侧股骨，使用DEXA双能X线BMD仪检测大鼠股骨BMD和骨矿物质含量；采用电子万能试验仪检测股骨最大负荷和刚度。

1.4血浆H2S含量检测 处死大鼠，收集血浆；配制NaHS标准品(10、20、40、60、80 μmol/L)，将H2S探针NDS-Az溶于纯酒精中(2.2 mmol/L)，使用96孔板(黑底)，每孔加入NDS-Az探针溶液10 μl，然后加入100 μl的血浆溶液或标准品溶液，轻微振荡以达到混匀的目的。激发波长360 nm、发射波长528 nm，通过酶标仪读取数值，最后计算标准曲线并根据标准曲线计算每个样本血浆中硫化氢的浓度。

1.5胱硫醚β合酶和胱硫醚γ分解酶mRNA含量检测 处死大鼠，剥离右侧股骨，液氮中磨碎，Trizol溶液抽提总RNA，定量后反转录，过程按照说明书进行，靶标基因的引物如下：3-巯基丙酮酸硫基转移酶：上游引物5′-ggctcagtaaacatcccattc-3′； 下游引物5′-tgtccttcacagggtcttcc-3′。胱硫醚β合酶：上游引物5′-atgctgcagaaaggcttcat-3′； 下游引物5′-gtggaaaccagtcggtgtct-3′。 胱硫醚γ分解酶：上游引物5′-cgcacaaattgtccacaaac-3′；下游引物5′-gctctgtccttctcaggcac-3′。将GAPDH设为内参，上游引物5′-gagctgaatgggaagctcac-3′； 下游引物5′-aaaggtggaggagtgggagt-3′。采用ABI7500定量PCR仪进行检测。

1.6统计学方法 采用SPSS15.0统计软件进行方差分析。

2 结 果

2.1长期有氧运动对去卵巢大鼠骨质的影响 与假手术组相比，去卵巢组股骨BMD和骨矿物质含量明显下降；而长期有氧运动可以显著增加股骨BMD和骨矿物质含量(P<0.05)。与假手术组相比，去卵巢组股骨极限负荷和刚度明显下降；而长期有氧运动可以显著增加去卵巢大鼠股骨极限负荷和刚度(均P<0.05)。见表1。

2.2长期有氧运动对去卵巢大鼠内源性H2S合成的影响 与假手术组相比，去卵巢大鼠血浆H2S水平明显下降；而长期有氧运动可以显著增加去卵巢大鼠血浆H2S水平(均P<0.05)。与假手术组大鼠相比，去卵巢大鼠股骨中H2S合成相关酶：胱硫醚β合酶和胱硫醚γ分解酶表达明显降低(均P<0.05)，3-巯基丙酮酸硫基转移酶的表达无明显变化(P>0.05)；而长期有氧运动可以显著增加去卵巢大鼠股骨中胱硫醚β合酶和胱硫醚γ分解酶表达水平(均P<0.05)，但是对3-巯基丙酮酸硫基转移酶表达无明显影响(P>0.05)。见表2。

2.3长期有氧运动对去卵巢大鼠MDA的影响 与假手术组大鼠相比，去卵巢大鼠血浆MDA水平明显增加(P<0.05)；而长期有氧运动可以显著减少去卵巢大鼠血浆MDA水平(P<0.05)。见表2。

表1 长期有氧运动对去卵巢大鼠的股骨骨质及股骨生物力学特性的影响

与去卵巢组比较：1)P<0.05，下表同

表2 长期有氧运动对去卵巢大鼠内源性H2S合成的影响

3 讨 论

在人、鼠等哺乳动物的多种组织和器官中都证实具有内源性H2S的存在〔8,9〕。H2S在体内有两种存在形式：1/3以H2S分子态存在；2/3以H2S钠盐形式存在。两者之间存在动态平衡，这样既保持了组织内H2S含量的稳定，又维持内环境酸碱度的平衡〔10〕。H2S的脂溶性较高，非常容易通过细胞膜进行跨膜转运，这一点对于其在骨组织中的功能和作用具有重要意义。

在MC3T3-E1成骨细胞中，H2S治疗可以对抗H2O2诱导的氧化应激损伤，促进骨钙蛋白的表达〔11〕。长期糖皮质激素的使用可以导致骨质疏松，研究发现地塞米松刺激MC3T3-E1成骨细胞，可以抑制细胞内胱硫醚β合酶和胱硫醚γ分解酶的表达；而给予H2S供体治疗可以减轻地塞米松诱导的成骨细胞活力下降和凋亡发生〔12〕。有研究显示单剂量硫氢化钠的治疗可以引起RANKL的表达上调和破骨细胞分化的短暂增加〔13〕。另有研究发现H2S供体治疗可以抑制癌细胞诱导的破骨细胞分化并在离体实验中抑制骨质溶解的发生〔14〕。另外，H2S供体治疗还可以抑制尼古丁和脂多糖诱导的人牙周膜细胞的破骨细胞性分化〔15〕；在牙周炎大鼠模型中，H2S治疗后，牙糟中破骨细胞数目明显下降〔16〕。在人间质干细胞中H2S供体治疗可以下调RANKL/OPG比例，从而抑制了破骨前体细胞的分化〔17〕。体外实验发现，H2S还可以抑制基质金属蛋白酶活性，而该酶对于降解骨组织中弹力纤维具有重要作用〔18〕。在去卵巢大鼠中，雌激素的缺乏诱导了骨质疏松的同时，抑制了骨组织中胱硫醚β合酶和胱硫醚γ分解酶的表达；在去卵巢小鼠血清中H2S含量明显降低〔19〕。这一点在本文的研究中得到进一步的证实。给予去卵巢小鼠以H2S供体GYY4137治疗，可以增加骨生成，减轻雌激素缺乏导致的骨质丢失〔19〕，提示雌激素缺乏后，内源性H2S的生成减少是促进动物骨质疏松的关键因素之一。

前期研究发现长期有氧运动可以增加高血压大鼠主动脉中内源性H2S的生成，从而起到血管保护的作用〔20〕。另有一项研究显示太极运动可以增加原发性高血压患者血浆H2S的含量〔21〕。本研究提示有氧运动可以通过上调骨组织中胱硫醚β合酶和胱硫醚γ分解酶的表达，从而增加内源性H2S的生成，抑制氧化应激，最终有助于减轻由于雌激素缺乏诱导的骨质疏松。

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