当归补血汤对S180荷瘤小鼠免疫器官及IL-2影响的研究

王艳杰，杨彦娟,康芯荣，孙阳，李明珠，刘旭，刘宏，代巧妹(黑龙江中医药大学基础医学院，黑龙江 哈尔滨 150040)

临床上在治疗肿瘤患者时，多采用攻邪软坚或健脾和胃法，有学者认为补益剂滋腻中焦，阻遏运化，不宜使用[1]。但近年来有大量研究表明一些补益剂在抗肿瘤实验中能够起到作用，包括当归补血汤[2]。当归补血汤是李东垣所创益气补血名方,多数研究发现当归补血汤能够在肿瘤放、化疗中起到增效减毒的作用[3]，但鲜有研究表明单独使用当归补血汤具有抑瘤作用[4]。因此我们选用不同剂量的当归补血汤，对S180荷瘤小鼠进行抗肿瘤研究，以了解其抑瘤作用的免疫学因素。

1 试剂、材料和仪器

1.1 药物与试剂

当归补血汤(黄芪90 g，当归18 g)均购自黑龙江中医药大学附属第一医院中药局。采用传统方法水煎煮108 g的生药，两次药液混合，静置2 h分层，取上层清液，与下层浑浊液离心后的上清液混合，浓缩至231 mL,约0.47g生药/mL，留31 mL(作低剂量组)，余下继续浓缩至100 mL，约0.94 g生药/mL，留40 mL(作中剂量组)，余下浓缩至40 mL，约1.41 g生药/mL(作高剂量组)。储4 ℃备用。环磷酰胺(CTX)(上海如吉生物科技有限公司，编号131011)。0.9%氯化钠注射液(哈尔滨三联药业有限公司，国药准字H23020612)。95%乙醇(AR，天津市天力化学试剂有限公司)。小鼠白介素2(IL-2)酶联免疫吸附测定试剂盒 (武汉伊莱瑞特生物科技有限公司)。

1.2 主要溶液的配制

PBS(现用现配)：A.称取Na2HPO4·12H2O 35.81 g加500 mL蒸馏水，B.称取NaH2PO4·2H2O 3.9 g加125 mL蒸馏水。量取A.385 mL+B.115 mL+ 500 mL生理盐水混合均匀，即配成0.1 mol/L、pH7.3的磷酸盐缓冲溶液。

1.3 实验动物与瘤株

60只ICR雌雄各半小鼠(准字号：SCXK(黑)2013-004)，体质量18～22 g，黑龙江中医药大学动物中心供应。S180细胞株：中国医学科学院肿瘤细胞库。

1.4 主要仪器

超净工作台HFsafe-1200(上海力申科学仪器有限公司)；电子分析天平FA124(上海舜宇恒平科学仪器有限公司)；台式离心机KA-1000(上海安亭科学仪器厂)；电热鼓风干燥箱DGX-9143B-1(上海福玛实验设备有限公司)；电热恒温水浴锅HH·S11-2-Ⅱ(上海跃进医疗器械厂)； Infinite®M1000 Pro全波长多功能酶标仪(瑞士帝肯 ，Tecan)。

2 方法

2.1 造模方法

采用腹腔接种瘤株的昆明种小鼠，7 d传代1次，经过3次传代后。选取接种7 d的小鼠5只，酒精局部消毒并抽取非溶血性腹水，共5 mL，生理盐水稀释、调整悬液浓度为1×106/mL，除正常组，以每只0.2 mL于其余50只小鼠右腋窝皮下消毒并接种。

2.2 分组及给药

60只小鼠随机分为正常组、阴性组、阳性(CTX)组(0.03 g/kg)、当归补血汤高(14.04生药/kg)、中(9.36 g生药/kg)、低剂量组(4.68 g生药/kg)。

接种瘤细胞后第2天开始给药，阴性组每日生理盐水灌胃0.2 mL/只；阳性组每只小鼠按0.03 g/kg隔日腹腔注射环磷酰胺；当归补血汤各组每日灌胃水煎剂0.2 mL/只。连续给药10 d。

2.3 实验记录

末次给药次日，称体质量，眼球取血待用，断颈法处死各组小鼠，剥取瘤、肝脏、脾脏并称重记录。计算体质量的变化、抑瘤率及各脏器指数。计算公式如下：

抑瘤率(%)=(1-给药组平均瘤量/造模组平均瘤重)×100%

脏器指数= 脏器质量(mg)/体质量(g)

2.4 数据分析

采用SPSS22.0进行数据处理。检验正态性，呈正态分布(若非正态分布用方法二)则用One-Way ANOVA方差分析，方差齐则用LSD-t进行组间比较(若方差不齐用方法二)。方法二：非正态分布或方差不齐的应用多独立样本非参数检验(Kruskal-Wallis Test)。P<0.05则差异有统计学意义。

3 实验结果

3.1 体质量变化情况

各组小鼠在实验后均有增加，阳性组增长最少，其余给药组增长明显。见表1。

表1 当归补血汤对移植性S180荷瘤小鼠体质量影响的比较

3.2 抑瘤率、移植瘤生长抑制率

与阴性组相比，给药各组的瘤重均低于阴性组，且存在显著性差异(P<0.01)；阳性组抑瘤率84.45%，其瘤重显著低于其余给药组(P<0.01)；当归补血汤中、高组抑瘤效果(抑瘤率分别为均显著高于低剂量组抑瘤效果P<0.01)，且中剂量组较高，但两组无显著性差异(P>0.05)。见表2。

表2 当归补血汤对移植性S180荷瘤小鼠的瘤生长影响的比较

注：与阴性组比较，▲▲P<0.01；与阳性组比较，**P<0.01；与当归补血汤高剂量组比较，##P<0.01

3.3 肝指数、脾指数和胸腺指数

数据处理发现，与正常组相比，阴性组肝、脾指数显著升高(P<0.01)；与阴性组相比，阳性组肝、脾指数均显著下降(P<0.01)；当归补血汤各组肝、脾指数与阳性组相比显著性升高(P<0.05)。见表3。

3.4 肿瘤细胞形态学的观察

当归补血汤各组瘤体经固定后取出修整，流水冲洗12 h，放入包埋机经彻夜脱水、透明，第二日即刻取出包埋、切片、展片、烘片后，再进行HE染色并封片，肿瘤组织切片即制作完成。

如图1中所示，显微镜下观察肿瘤组织，阴性组瘤细胞排列紧密，大量瘤细胞核质色深呈多叶型、核质比大，提示瘤细胞处于生长、分化旺盛阶段。当归补血汤组瘤细胞排列稀疏，核深染的瘤细胞占比随给药剂量加大而降低，组织内出现破裂、空洞，部分区域被非瘤组织取而代之，低剂量组及阴性组有血管存在，高剂量组与中剂量组未见大量血管。

表3 当归补血汤对移植性S180荷瘤小鼠免疫器官影响的比较

注：与正常组比较，##P<0.01；与阴性组比较，▲▲P<0.01；与阳性组比较，*P<0.05

图1 肿瘤组织形态图(10×40)

3.5 各组药物对小鼠血清IL-2的影响

小鼠血液静置2 h，3 000 r/min离心20 min，取上清液，使用相应ELISA试剂盒按照说明书测定阴性组、当归补血汤中、高剂量组血清中IL-2的浓度(由于低剂量组抑瘤率较低，只选择两个剂量组测试)。与阴性组相比，当归补血汤中、高剂量组IL-2显著性升高(P<0.01)见表4和图2。

4 讨论

当归补血汤对S180荷瘤小鼠有抑瘤作用，从抑瘤率来看，随着剂量增大，抑瘤率升高缓慢，以中剂量(9.36g生药/kg)抑瘤率最高；从HE染色后的切片观察结果来看，高剂量组肿瘤组织中浸入的炎性细胞、肿瘤细胞凋亡状态较中剂量明显。出现这种现象的原因有二：一是与操作者的瘤株剥离手法，导致瘤重的误差；二是肿瘤切片的制备手法，导致切片断面不同导致。

表4 当归补血汤对移植性S180荷瘤小鼠细胞因子IL-2水平的影响比较

注：与阴性组比较，▲▲P<0.01

图2 荷瘤小鼠血清IL-2标准曲线图

当归补血汤各组肝、脾指数均明显升高，且与阴性组无显著差异，表明当归补血汤对免疫器官中免疫细胞具有活化作用，增强了免疫器官的防御能力。同时，当归补血汤能促进免疫器官中的免疫细胞IL-2的分泌。IL-2是主要由活化的CD4+Th1细胞产生的具有广泛生物活性的细胞因子，是调控免疫应答的重要因子，参与肿瘤监视。IL-2也能够促进淋巴细胞增殖，提高NK细胞活性，NK细胞又能促进IFN-γ分泌，而IFN-γ是抑制肿瘤细胞增殖的细胞因子。

综合以上各种因素，可以推测当归补血汤抗肿瘤作用是通过提高机体免疫器官的防御能力，活化免疫细胞，诱导产生IL-2，促进炎症细胞浸润入肿瘤组织，从而抑制肿瘤细胞的生长。这与已有报道称当归补血汤提取液能通过提高IL-2和IFN-γ来能增强CTL细胞毒效应以抗肿瘤的作用是一致的[5]。

[1] 杨青青.对恶性肿瘤患者化疗所致不良反应的中医护理[J].中国医药指南,2012,10(3):272-274.

[2] 李娇,刘晓波.中药在肿瘤治疗中的减毒增效作用的研究进展[J].药学研究,2015,34(4):229-231.

[3] 黄朝忠,刘智,苏颖.当归补血汤对肿瘤化疗增效减毒作用的研究进展[J].吉林中医药,2014,34(9):962-964.

[4] 孙玉敏,宋福成,吴晓光.当归补血汤抑制荷瘤小鼠肿瘤生长的作用[J].现代生物医学进展,2006,6(9):31-32，35.

[5] 刘清君,胡敏棣,刘彩梅,等.超滤膜提取当归补血汤对荷瘤小鼠脾细胞IL-2和IFN-γ的诱生作用[J].西安交通大学学报(医学版),2008,29(4):472-474.