川楝子炒制前后对大鼠在体肠吸收特性的影响

张景珍，王英姿，李文华，张春泥，王思雨，聂瑞杰，孙振阳(北京中医药大学 中药学院，北京 102488)

川楝子为常用传统中药，有小毒，临床使用时多采用2015版《中国药典》收载的清炒法炮制后入药，以达到减毒的目的。炒川楝子可缓和苦寒之性，减少滑肠之弊，而且能增强理气止痛、镇痛抗炎的作用[1]，但是目前对其炮制减毒增效的作用机理尚不明确。吸收是研究中药发挥作用、产生疗效或发生毒副反应的基础和关键，也是阐明有毒中药炮制机理的重要环节[2]，因此科学研究中药肠吸收动力学，探究其肠吸收特性是极为必要的。

本文采用在体肠灌流模型，以川楝素为指标成分研究川楝子炒制前后其提取物对大鼠在体肠吸收特性的影响，以探索其炮制前后主要化学成分在体内的吸收差异及变化，为临床合理安全使用提供科学依据。

1 材料

1.1 动物

健康雄性Wistar大鼠，SPF级，体质量250 g左右，购自斯贝福实验动物科技有限公司，合格证号：SCXK(京)2016-0002。

1.2 仪器

LC-20AT高效液相色谱仪(日本岛津)；BT101L蠕动泵(保定雷弗流体科技有限公司)；HJ-6A多头磁力加热搅拌器(常州国华电器有限公司)；HH-2数显恒温水浴锅(常州国华电器有限公司)；DCY系列可调式氮吹仪(青岛海科仪器有限公司)； BT125D电子天平(北京赛多利斯有限公司)；德国Eppendorf移液枪。

1.3 药物与试剂

川楝素(上海诗丹德)、川楝子生品提取物、川楝子炒品提取物供试品(实验室自制)；Krebs-Ringer's试剂(每1000 mL含六水合氯化镁0.084 g,氯化钾0.35 g,氯化钠7.80 g,氯化钙0.37 g,葡萄糖1.48 g,碳酸氢钠1.37 g,磷酸二氢钠0.02 g，pH7.4，简称为K-R液，购于国药集团化学试剂有限公司)；水合氯醛(国药集团化学试剂有限公司)；十二烷基硫酸钠(简称SDS，北京市福晨化学试剂厂)；甲醇、乙腈为色谱纯；乙酸乙酯为分析纯。

2 实验方法

2.1 溶液的配制

2.1.1 Krebs-Ringer's(K-R)营养液的配制

称取六水合氯化镁0. 084 g,氯化钾0. 35 g,氯化钠7. 80 g,氯化钙0. 37 g,葡萄糖1.48 g,碳酸氢钠1. 37 g,磷酸二氢钠0. 02 g，溶解于1 000 mL去离子水中用1 mol/LHCl调pH至7.4。

2.1.2 川楝素对照品溶液的配制

精密称取5.47 mg川楝素对照品于5 mL容量瓶中，配制成1.094 mg/mL的对照品储备液。

2.1.3 生川楝子提取物供试液的配制

精密量取一定量川楝子生品提取物，加含0.8% SDS的K-R溶液定容至100 mL。

2.1.4 炒川楝子提取物供试液的配制

精密量取一定量炒川楝子提取物，加含0.8% SDS的K-R溶液定容至100 mL。

2.2 在体肠吸收实验

2.2.1 肠灌流液收集

试验前将管道用供试液饱和，至出口液与供试液浓度一致，以消除试验中管道对药物的吸附。大鼠于12～18 h内禁食不禁水，以10%水合氯醛按0.4 g/kg进行腹腔注射麻醉。将大鼠于鼠板固定，在红外灯下保温，沿腹中线切开腹腔，分离待考察肠段(各肠段区间为：十二指肠自幽门1 cm处开始取10 cm；空肠段自幽门15 cm处开始取10 cm；回肠自盲肠上行20 cm处往下量取10 cm；结肠段从盲肠后端开始取10 cm)，两端切口并插管，用预热至37 ℃的K-R液将肠内容物冲洗干净(流出液中无可见物)，结扎，用K-R溶液平衡15 min，泵入空气排尽K-R液。再取供试液灌入肠道，用蠕动泵在进口处用质量已知含有供试液的小瓶灌流肠段，体积流量设定0.2 mL/min，开始计时，约30 min 后吸收平稳。出液口处用另一已称总质量的小瓶收集，每隔15 min迅速更换1次供试液小瓶和收集液小瓶，分别在45～180 min取样，称定质量，计算灌入和收集的供试液质量。在-20 ℃冷冻贮存样品，待测。实验结束后剪下相应的肠段，测量长度(L) 和内半径(r)。

2.2.2 空白肠灌流液的收集

取Wistar大鼠，按照2.2.1项下操作用K-R溶液对十二指肠、空肠、回肠、结肠进行灌流3 h，收集肠道不同部位的灌流液，混合均匀，用于本实验方法学考察所需样品的配制。

2.2.3 生川楝子和炒川楝子提取物中川楝素在肠道中的吸收

取Wistar大鼠，分别按照2.2.1项下操作用生川楝子提取物供试液和炒川楝子提取物供试液对十二指肠、空肠、回肠、盲肠部位进行灌流，收集45～180 min灌流液，并称重。

2.2.4 样品处理方法

精密吸取灌流液500 μL，加乙酸乙酯1 mL涡旋3 min，6 000 r/min离心10 min，吸取上层乙酸乙酯900 μL，再加入乙酸乙酯1mL涡旋3 min，6 000 r/min离心10 min，吸取上层乙酸乙酯1mL，合并两次萃取液，氮气吹干，加甲醇500 μL复溶，过0.45 μM滤膜，取20 μL进行液相分析。

2.3 方法学考察

2.3.1 色谱条件

Extend C18色谱柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流动相为乙腈(A)-水(B)(33∶67)；流速1.0 mL/min，检测波长为215 nm，柱温30 ℃，进样体积20 μL。

2.3.2 专属性考察

分别取空白肠灌流液、对照品空白灌流液、提取物灌流液各500 μL，按上述“样品处理方法”项下涡旋离心处理，按“色谱条件”项下进样分析，空白灌流液中的成分不影响川楝子提取物中指标成分川楝素的含量测定。

2.3.3 线性关系考察

将川楝素对照品储备液用甲醇稀释成437.6、218.8、109.4、54.7、27.35、13.625和6.813 5 μg/mL的标准曲线工作液。分别精密吸取上述标准曲线工作液500 μL，置于2 mL EP管中，于通风橱37 ℃恒温水浴上氮气吹干，加空白灌流液500 μL，涡旋3 min，按“样品处理方法”项下操作，建立标准曲线。以浓度为横坐标(X)，峰面积为纵坐标(Y)进行线性回归，得其标准曲线方程为：Y=22 143X-118 504，R2=0.996 1，表明川楝素在6.813 5～437.6 μg/mL范围内的线性关系良好。

2.3.4 精密度与准确度的考察

用空白肠灌流液分别配制低、中、高3种浓度的质控样品(QC)，按上述“样品预处理方法”项下进行样品处理，将同一样品与同一天的早、中、晚各进针1次，分别计算其RSD值，即为其日内精密度。将同一样品连续3 d进样，分别计算其RSD值，即为日间精密度。用空白肠灌流液分别配制低、中、高3种浓度的质控样品各5份，按上述“样品预处理方法”项下处理进样测定，分别计算其日内精密度的RSD值为3.9%～11.2%，日间精密度的RSD值为3.2%～10.1%，准确度的RSD值为2.5%～11.0%，均符合药物分析的要求。

2.3.5 回收率考察

用空白肠灌流液分别配制高、中、低浓度的混标质控样品，每个浓度进行5样本分析(n=5)，按“样品预处理方法”项下处理，在上述色谱条件下进液相检测，获得相应峰面积。按由甲醇溶液配制的系列浓度所得的标准曲线方程计算浓度，以测定浓度与加入浓度之比计算回收率，测得其结果为6.43%～8.65%，符合药物分析的要求。

2.3.6 稳定性考察

用空白肠灌流液配制与供试液相同浓度的川楝子生品提取物和川楝子炒品提取物各3份，置37 ℃恒温水浴中3 h，分别于0、30、60、90、120、180 min取样分析(n=3)，将所测得的川楝素含量与0时所测值作百分比，结果表明，川楝素稳定性良好，RSD值均小于5%。说明在川楝子炒制前后提取物中川楝素在空白肠灌流液中稳定性良好。

2.4 数据分析

分别取不同时间段灌流液按“2.2.4样品预处理方法”项下处理，按“2.3.1色谱条件”项下进样分析。采用重量法按如下公式计算药物的吸收速率常数(Ka)和药物表观渗透系数(Papp)。

Ka= ( 1-CoutVout/ CinVin) Q/πr2L

Papp=-Q·ln( CoutVout/ CinVin)/2πrL

公式中Vin和Vout分别为肠道进、出口灌流液的体积(mL)，Cout和Cin为肠道进、出口灌流液中药物的质量浓度(μg/mL)采用重量法计算。Q为体积流量(mL/min)，L和r分别为灌流肠段的长度(cm)和肠壁周长(cm)。

2.5 统计分析方法

3 结果

采用在体单向肠灌流对生川楝子提取物和炒川楝子提取物中川楝素在肠道中的吸收进行了考察，通过计算得其Ka、Papp值。有文献报道表明Papp<3×10-6cm/s时药物吸收较差，Papp>2×10-5cm/s时药物吸收较好，二者之间药物吸收中等[3-4]。结果表明，川楝子在肠道中的吸收较好。炒制前后川楝子提取物中川楝素在不同肠段中的吸收存在差异(P<0.05)，生品川楝子提取物中川楝素在十二指肠、空肠、回肠、结肠的吸收均大于炒品提取物。由此说明，川楝子炒制后可通过影响川楝子在肠道的吸收降低毒性。川楝素在不同肠段的吸收差异可能与四个肠段存在的载体和转运蛋白不同有关[5]。结果见表1。

表1 炒制前后川楝子提取物中川楝素在大鼠不同肠段的Ka值和Papp值

注：与生品中川楝素相比，*P<0.05，**P<0.01

4 小结与讨论

川楝素为三萜类成分，水溶性差，因此所以灌流液中需加入助溶剂以增加其溶解性。本研究对目前常用的助溶剂吐温-80，十二烷基硫酸钠，羧甲基纤维素钠[6-9]的助溶效果进行了考察分析。经分析可知结果0.8%十二烷基硫酸钠的助溶效果最好。此外，本研究预实验尚对甲醇、乙腈两种溶剂的复溶效果进行了考察，结果甲醇复溶得到的色谱峰峰形较乙腈好，因此本文选择以甲醇为复溶剂。

实验结果表明，川楝子的指标成分川楝素在肠道中的吸收良好，生川楝子和炒川楝子中川楝素在不同肠段存在吸收差异，说明川楝子炒制会影响川楝素的肠道吸收速率和药物的表现渗透。川楝素在不同肠段的吸收情况存在差异，这可能与不同肠段存在酶的种类与数量的不同有关[10-11]。川楝子炒制后其吸收速率常数(Ka)和药物表观渗透系数(Papp)均显著降低,这可能与川楝素的含量及其转运机制有关，初步揭示了川楝子炒制减毒的机理。

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