东北油豆角枯萎病病原菌的分离、纯化与鉴定

王 杰，周 萌，杜伟玲

（哈尔滨市农业科学院生物中心，黑龙江 哈尔滨 150029）

油豆角是我国东北地区（黑龙江、吉林为主）特有的一种优质食荚菜豆品种，含有较高的蛋白质（干质量的20%以上），含有人体必须的18种氨基酸、丰富的膳食纤维、多种维生素和矿物质。

油豆角枯萎病俗称萎蔫病、死秧。一般发病率在30%～50%，个别重病田病株率高达90%以上。病原菌通过根部伤口或根毛顶端细胞侵入，进入寄主导管内发育，随水分的运输迅速扩展到植株顶端，堵塞导管，而使病株萎蔫。初花期开始发病，结荚盛期植株大量枯死，严重阻碍油豆角生产。

为了控制枯萎病的危害，首先要研究其发病的原因。试验对引起发病的病原菌进行分离和鉴定，以期为有针对性地防治该病害奠定基础。

1 材料和方法

1.1 试验材料

PSA培养基：去皮马铃薯200 g、蔗糖20 g、琼脂粉15 g，加水至1 000 mL，pH值5.0～6.0；致病性鉴定所使用的油豆角品种：将军一点红（当地主栽品种）。试剂盒：Ezup 柱式真菌基因组 DNA 抽提试剂盒、SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒。

1.2 试验方法

1.2.1 病原菌的分离

采用组织分离法：将剪取的油豆角茎基部病组织样品经2.0%（V/V）NaClO表面灭菌0.5～1.0 min，再用灭菌蒸馏水冲洗。用灭菌滤纸将样品擦干，后用解剖刀将其切成小薄片，置于含有PSA 培养基的培养皿中，28±2 ℃的培养室中培养5～7 d，将从样本中得到的分离物进行单孢分离（稀释分离法），将单孢分离物转接于新的含有PSA培养基的培养皿中，28±2 ℃条件下培养7 d备用。

1.2.2 病原菌的鉴定

形态学观察：培养7～10 d后观察菌丝体形态，采用数码倒置显微镜EVOS观察其分生孢子的形态。

致病性测定：病原菌的接种方法参考Haware和Nene[1]的方法。将玉米粉与蛭石按1∶2（V/V）的比例制成混合物，在1 000 mL规格的三角瓶中装入400 mL混合物，121 ℃、0.2 MPa条件下灭菌30 min，灭菌2次。向玉米粉混合物中加入50 mL灭菌蒸馏水，混合均匀后接入病原菌（培养皿直径为90 mm，且长满病原菌菌丝），25～28 ℃条件下培养7～10 d，每天摇晃三角瓶使病原菌均匀生长。将接种体与灭菌的营养土按照1∶10（V/V）的比例混合，取0.01 g接种混合土悬浮于1 mL灭菌水中，用血球计数板计算接种混合土中病原菌的含量，使接种终浓度达到5.0×106cfu/g。将用0.5%NaClO溶液表面灭菌的油豆角种子播种于装有上述接种混合土的营养钵中，致病性测定在人工气候箱中进行，30±2 ℃条件下，每日光照12 h，适时浇水。以未接种病菌的灭菌营养土作为对照，定期观察植株生长情况。根据柯赫氏法则，从发病的植株上再次分离病原菌进行纯培养，并观察其特征。

分子生物学鉴定：应用Ezup柱式真菌基因组 DNA 抽提试剂盒进行病原菌基因组DNA提取。PCR扩增采用真菌鉴定通用引物ITS1：TCCGTAGGTGAACCTGCGG，ITS4：TCCTCCGCTTATTGATATGC；PCR 反应体系：Template（基因组 DNA 20～50 ng/μL）0.5 μL、10×Buffer（加Mg2+）2.5 μL、dNTP（各2.5 mM）1 μL、Taq酶0.2 μL、ITS1（10 μM）0.5 μL、ITS4（10 μM）0.5 μL，加双蒸水至25 μL。PCR循环条件：预变性4 min，94 ℃变性45 s，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，共计30个循环，然后72 ℃延伸修复10 min，4 ℃终止反应；用1%琼脂糖凝胶电泳，150 V、100 mA电泳20 min；用SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒纯化回收目标条带，PCR产物交由上海生工生物工程有限公司直接测序。将测得的rDNA-ITS序列放到NCBI基因序列数据库中，并利用BLAST技术进行分析。

专化型鉴定：方法同上述致病性鉴定方法，只是把接种对象扩大到豇豆、扁豆、豌豆、菜用大豆和蚕豆，其中包括油豆角，每处理接30株苗，以清水处理作为对照。

2 结果与分析

2.1 病原菌的形态

在固体马铃薯蔗糖琼脂（PSA）培养基上，菌落呈淡紫色；大型分生孢子镰刀形，有3～5个隔；小型分生孢子椭圆形，有0～1个隔（图1）。

2.2 病原菌的致病性鉴定

未接种病原菌的植株正常生长（图2-A左）；接种病原菌的植株出现的白化现象后萎蔫（图2-A右），其茎的维管束变褐色（图2-B）。试验共分离到镰刀菌菌株6株，其中对油豆角（将军一点红）有致病性的1株。

2.3 病原菌的分子生物学鉴定

病原菌的rDNA-ITS序列测定结果如下：

将DNA序列放到NCBI核酸数据库中通过BLAST比对，结果显示此序列与近100个尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum）分离物或专化型同源性达100%，由此可以推断，病原菌应该属于尖孢镰刀菌种。

2.4 专化型鉴定

以清水为对照，寄主为油豆角，其发病率为0.00%。另外，从表1可以看出：病原菌强侵染油豆角，弱侵染豇豆，不侵染扁豆、豌豆、菜用大豆和蚕豆。

3 结论与讨论

镰刀菌的鉴定是一项非常复杂的工作，传统方法主要采用形态特征和生理生化指标作为判断依据，方法容易受多种外界因素的影响而产生很大的不确定性。自从发现真菌rDNA-ITS区具有丰富变异的特点，常常将这一可变区作为真菌菌种和分离物鉴定的可靠依据之一[2]。刘波等[3]对引起瓜类枯萎病的尖孢镰刀菌多个菌株的rDNA-ITS区序列及串珠镰孢菌多个菌株的rDNA-ITS区序列进行多重比较，结果发现：来自不同专化型的菌株rDNA-ITS区序列可能完全相同，而同一专化型的菌株rDNA-ITS区序列也有可能存在一定的差异，说明ITS区序列无法用于区分菌株的专化型。另外，余仲东等[4]也认为ITS区序列不适于种下阶元划分。研究中，2株病原菌rDNA-ITS区序列与近100个尖孢镰刀菌分离物或专化型的同源性达100%，再次验证了通过rDNA-ITS区序列只能鉴定到种而无法鉴定到种以下分类单元（比如专化型）这一事实。

表1 尖孢镰刀菌专化型鉴定结果

图1 病原菌形态及分生孢子

图2 油豆角病原菌的致病性鉴定情况

张吉祥等[5]归纳总结了DNA分子标记（包括RFLP、RAPD、AFLP、ISSR和SCAR等）、毒性基因和转座子等技术在尖孢镰刀菌专化型及其生理小种鉴别方面的应用，指出分子方法尽管具有快速、灵敏、特异性高等诸多优点，但也都有各自的局限性，限制了其广泛应用。在生产上，尖孢镰刀菌专化型鉴定大部分还是利用传统的鉴定方法，主要通过菌株在不同作物上的致病性测定。

结合形态学、分子生物学和专化型的鉴定结果，可初步把病原菌鉴定为尖孢镰刀菌菜豆专化型。

[1]HAWARE M P, NENE Y L. Races ofFusarium oxysporum[J]. Plant Disease,1982,66(9):809-810.

[2]SCHMIDT O, MORETH U. Data band of rDNA-ITS sequences from building-rot fungi for their identification[J]. Wood Science and Technology,2002,36(5):429-433.

[3]刘波,黄俊生,肖荣凤.尖孢镰刀菌生物学及其生物防治[M].北京:科学出版社,2013.

[4]余仲东,刘小勇,曹支敏.松杨栅锈菌的ITS序列和微卫星分析[J].中国农业科学,2006,39(6):31-34.

[5]张吉祥,凌键,谢丙炎.尖孢镰刀菌专化型及生理小种分子检测研究进展[J].中国农学通报,2013,29(36):338-342.蔬