葡萄糖-6-磷酸脱氢基因检测技术在蚕豆病诊断中的应用

罗家宏

（广东省江门市妇幼保健院医学遗传中心 江门 529000）

蚕豆病是一种X连锁不完全显性遗传性溶血性疾病，其实质是G6PD基因发生突变，故又被称之为G6PD缺乏症。该病男性发病率高于女性，致病机制是G6PD基因发生突变，编码蛋白结构受到影响进而引起G6PD酶的活性降低[1]。该病在世界范围内约4亿人受累，以地中海周围、印度、东南亚等地区高发。我国分布于海南、广东、广西、云南等地，发病率在11%左右，极个别地区可达30%以上[2]。为进一步探究诊断效果，本研究将我院收治的128例蚕豆病患者作为研究对象，探讨不同检测技术在蚕豆病诊断中的应用价值。现报道如下：

1 资料与方法

1.1 一般资料 对我院2016年12月～2017年12月收治确诊为蚕豆病的128例患者进行分析，男78例，女50例，年龄 21～62岁，平均（39.44±3.51）。均进行荧光定量PCR法检测及高铁血红蛋白还原法检测。

1.2 研究方法

1.2.1 仪器与试剂 BeckmanCoulter DXC800全自动生化分析仪、ABI 7500荧光PCR仪。高铁血红蛋白还原实验MHBR试剂（2.5%的NaNO2和0.000 4 M美兰等量混合），引物（美国Invitrogen公司），Hot Star Taq酶（德国Qiagen公司）。

1.2.2 检测方法 荧光定量PCR法：对128例患者EDTA抗凝静脉血用QIAamp DNA Blood Mini Kit按照说明书提取DNA，－20℃保存，以荧光PCR方法为技术原理，通过设计特异的Taqman探针对6 个 常 见 突 变 位 点（G1376T、G1388A、A95G、A871G、G392T、C1024T）进行合管检测，以有无扩增曲线做定性突变检测，同时以人类基因组的β-actin基因为模版设计扩增引物对实验进行内控监测。模板制备和引物、探针设计合成按QIAamp DNA Blood Mini Kit说明书操作提取外周血DNA，－20℃保存。多重PCR引物和特异识别突变位点的Taqman MGB探针设计用Primer Express 3.0软件完成，由上海英潍捷基公司合成。PCR体系及程序PCR体系：G6PD基因A、B两管三重PCR扩增PCR反应总体积均为25 μl，包括DNA模板2 μl（总量 20～100 ng），10×Hot Star Taq PCR 缓冲液2.5 μl，25 mmol/L 的 MgCl溶液 21.5 μl，25 mmol/L的 dNTPs 0.2 μl，10 μmol/L 的特异性扩增上、下游引物对 0.5～1.0 μl，10 μmol/L 的 Taqman MGB 探针0.5～0.9 μl，10 μmol/L 的 β-actin 上、下游扩增引物0.4 μl，10 μmol/L 的 β-actin Taqman 探针 0.4 μl，灭菌水补足至25 μl。PCR程序：94℃预变性5 min；94℃15 s，69℃32 s，共 40个循环；69℃32 s采集荧光信号。高铁血红蛋白还原法：肝素抗凝血，调整血浆与红细胞比例约1∶1；用移液器吸取50 μl全血加入 50 μl的 MHBR 试剂，混匀，37 ℃4 h；再加入双蒸水4.9 ml，混匀，2 min后显色观察结果：呈鲜红色者为正常；呈棕色、棕红色或紫色为缺乏。

1.3 观察指标 观察所有患者检测结果，比较两组诊断价值。

1.4 统计学处理 实验结果用统计软件SPSS19.0展开分析，计数资料采用例（%）表示，行χ2检验，P＜0.05代表组间数据无显著差异。

2 结果

荧光定量PCR法检测及高铁血红蛋白还原法检测的诊断准确率分别为99.22%、85.94%，P＜0.05。见表1。

表1 对比两组诊断准确度[例（%）]

3 讨论

蚕豆病患者临床表现变化不一，有些患者无任何症状，而有些则发生新生儿黄疸、急性溶血等，严重者可出现新生儿期重症核黄疸，造成死亡或永久性神经系统的损伤。因此早期诊断显得尤为重要[3]。

蚕豆病有很多种检测方法，高铁血红蛋白还原法就是其中之一，但该方法受主观因素影响大，酶法对杂合子的检出率不理想，结果为弱阳性时，容易出现主观误判，会出现模棱两可的情况，临床诊断效果不佳[4～5]。厉勇等[6]研究表示，可对蚕豆病采用荧光定量PCR法进行检测诊断，其诊断准确率可达99.00%。本研究结果表明，荧光定量PCR法检测准确率比高铁血红蛋白还原法检测高（P＜0.05）。荧光PCR检测方法具有以下优势：（1）结果能确定患者基因型，便于患者进行产前诊断；（2）检测耗时短，1 h内即可完成；（3）结果清晰直观，易于判断和分析；（4）荧光PCR法中检测的6个突变位点能涵盖大部分蚕豆病基因。本研究存在的不足与局限性：（1）样本选取存在一定局限性，主要以2017年的患者为初始样本，虽然按相应的标准进行了筛选，但所选取的标本是否合理有待商榷；（2）样本选取例数较少，临床可进一步扩大研究对象人数，提升准确性。

综上所述，对蚕豆病患者采用荧光定量PCR法检测，其诊断准确率较高，耗时短，此方法在临床上值得进一步推广使用。

[1]余超,于洁,宪莹,等.儿童G6PD缺乏症355例临床分析[J].中国小儿血液与肿瘤杂志,2015,20(3):126-130

[2]张丽芸,马鑫,于布为.蚕豆病合并脊柱侧弯患者行房间隔缺损修补术一例[J].临床麻醉学杂志,2016,32(3):312

[3]中华预防医学会出生缺陷预防与控制专业委员会新生儿筛查学组,中国医师协会医学遗传医师分会临床生化遗传专业委员会,中国医师协会医学遗传医师分会临床生化遗传专业委员会中国医师协会青春期医学专业委员会临床遗传学组,等.葡萄糖-6-磷酸脱氢酶缺乏症新生儿筛查、诊断和治疗专家共识[J].中华儿科杂志,2017,55(6):411-414

[4]张格,于洁,李蕙,等.31例G6PD缺乏症患儿基因突变与临床表现分析[J].中国小儿血液与肿瘤杂志,2015,20(6):299-304

[5]包和婧,朱立新,梁永豪,等.骶尾部卵黄囊瘤合并蚕豆病1例[J].广东医学,2014,35(11):1808

[6]厉勇,杨明,菲肖琨.贵阳地区新生儿G6PD酶筛查结果分析[J].中国实验诊断学,2014,18(7):1171-1172