硒化银量子点的制备及生物应用

王珊珊，王玥，李金华

（长春理工大学 理学院，长春 130022）

近年来，越来越多的研究结果表明，近红外量子点作为一种新型的纳米荧光探针在生物检测方面具有十分明显的优势［1-3］。这主要是由于近红外波段作为“第二生物窗口”（700-900nm），具有的背景干扰小、穿透深度大等特点。这就使得近红外量子点因其能克服可见光量子点进行深层组织成像时易受干扰的缺陷等，在生物成像应用中更具优势［4］。并且，随着生物成像领域研究的快速发展，越来越多的近红外量子点被广泛用于生物大分子和细胞标记［5、6］、组织和活体细胞成像［7、8］、肿瘤模型定位［9-11］、临床诊断［12］等多个领域并取得了突破性的进展。但是，目前所涉及到的近红外量子点多为合金量子点，如 CdSeS、CdHgTe、CdSexTe1-x等。这类合金量子点的弊端在于量子点本身含有重金属Cd，从而使得其在生物领域的应用存在一定局限性［13］。因此，寻找一种近红外无镉荧光量子点以此来扩充近红外量子点在生物标记领域的应用是十分必要的。

硒化银（Ag2Se）作为一种新型的近红外二元含银量子点，因其低毒性、尺寸小且具有优异的近红外光学特性等优势而越来越被广大科研工作者所重视。这种量子点的出现，是对合金量子点在生物领域存在局限性的一种有利补充。一方面，它弥补了含重金属元素（镉或铅）量子点对环境和生物体系毒性较大的问题，可以有效地降低量子点的生物毒性。另一方面，由于其本身为近红外波段量子点，可以很好的与生物组织本身的自发荧光相区分，提高细胞分辨能力，且具有较深的穿透深度，能有更好的进行生物应用。2004年，Guo等［14］利用室温转化法，分别以乙二胺与氨水做模板合成了硒化银量子点，并对合成的硒化银样品进行了X-射线衍射分析，并在透射电子显微镜下研究了模板对合成硒化银形态的影响。2012年，Cui等［15］利用油相合成法实现了对Ag2Se量子点的制备并对其进行电化学测试，实验结果表明Ag2Se量子点与K2S2O8为共反应物作为阴极发射极在GCE材质上具有十分优异的电化学特性。2016年，Shi等［16］分别利用 TOP-Se以及ODE-Se作为Se源，使用高温油相合制备出了量子产率为23.4%的高质量Ag2Se量子点，并通过改变反应时间实现了对量子点尺寸以及发射峰值的调控。上述结果表明，Ag2Se作为一种全新的近红外荧光量子点已经越来越被人们所重视。但是，人们在对其进行研究过程中却往往忽视了制备过程中Ag与Se的配比对所制备的Ag2Se量子点所带来的影响。因此，开展对Ag2Se量子点的制备并对Ag：Se比例给Ag2Se量子点所带来的诸如尺寸、稳定性、光学特性等因此带来的影响并寻找出Ag：Se比例的最优解是亟待进行的。

基于上述原因及情况介绍，本文通过高温油相合成法实现对Ag2Se量子点进行制备，通过改变Ag∶Se比获得不同尺寸的Ag2Se量子点，并对所制备的量子点从光学特性及结构特性方面进行对比分析，以此寻找制备该种量子点的最佳Ag∶Se比。此后，利用DSPE-PEG对量子点进行亲水修饰使其具备亲水性，并对修饰后的量子点进行物化特性表征分析，以此验证将Ag2Se应用于生物标记领域的可行性，为这种量子点在生物领域的应用提供可靠依据。

1 实验部分

1.1 试剂与仪器

硒粉（Se，＞99%），醋酸银（AgAc，99.99%），十二烷基硫醇（DT，98%），三正辛基磷（TOP，90%）；上述药品均购自Alfa公司，二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇（DSPE-PEG，＞99%），十八烷烯（ODE，90%），牛血清蛋白（BSA，≥98%）上述药品均购自Sigma公司，叶酸（FA，≥98%）购自TCI公司，乙醇购自长春昊迪化学仪器有限公司，实验所需蒸馏水为实验室自制。

透射电子显微镜，高精度电子天平，离心机，紫外可见近红外分光光度计，荧光光度计，酶标仪，瞬态光谱仪，X射线衍射仪，胶体粒度粒径分析仪，磁力搅拌器，傅里叶变换红外光谱仪，荧光倒置显微镜，CO2培养箱等。

1.2 实验过程

将总摩尔质量为1mmol硒粉（Se）与10ml的三正辛基磷（TOP）常温搅拌30min，得到硒源。取0.2 mmol醋酸银（AgAc）和1.61mmol十二烷基硫醇（DT），加入5mL十八烷烯（ODE）在165℃度下隔绝空气搅拌30min。取1ml硒源加入5mL十八烷烯（ODE）在110度下反应30min得到Ag2Se量子点将溶液移至离心管中以6800转离心10min，移去上清液，重复上述步骤离心3-4次确保杂质的完全剔除，最后将得到的Ag2Se量子点溶于氯仿中，保存留作后续表征和应用。不同比例Ag2Se量子点实物图如图1所示。

图1 不同Ag∶Se比Ag2Se实物图

2 油性Ag2Se量子点物理表征

2.1 油性Ag2Se量子点的透射电镜表征

透射电子显微镜（TEM）是观察纳米材料形貌特征的一种必不可少的手段。如图2所示a、b、c、d为Ag∶Se为不同比例时所制备的油性Ag2Se量子点。由图可以看出，不同Ag∶Se摩尔比（1∶1、2∶1、3∶1、4∶1）所制备的Ag2Se量子点均成点状分布，粒径分布均匀，分散度较好。不同Ag：Se比所制备的Ag2Se量子点的平均粒径分别为（a）3.79nm、（b）3.81nm、（c）4.40nm、（d）5.28nm。并且随着Ag：Se比例的增加，Ag2Se量子点的平均粒径也相应增加。

图2 不同Ag∶Se比Ag2Se量子点TEM图

2.2 Ag2Se量子点的吸收特性研究

通过对紫外-可见-近红外分光光度计能够对材料吸收光谱进行测定。因此我们对不同Ag∶Se所制备的Ag2Se量子点进行了相应吸收光谱测定，测试结果如图3所示。通过对吸收光谱的分析可以发现，在Ag∶Se为1∶1时所制备的Ag2Se量子点在690nm处有较强吸收峰，并且随着Ag∶Se比值的增大，量子点吸收峰会发生相应“红移”，且吸收强度逐渐在减弱。针对这一“红移”现象，可以有如下解释。

图3 不同Ag∶Se比Ag2Se量子点吸收光谱图（1∶1，2∶1，3∶1，4∶1）

通过改变Ag与Se的配比制备Ag2Se量子点，根据Kayanuma理论对电子空穴相关性解释并结合Brus公式发现，量子点的尺寸主要依赖于量子点带隙能量的变化公式可表示为：

其中Eg(qd)为量子点的带隙能量，Ebulk为半导体的带隙能量，R为量子点的粒径，m∗e为受激电子的有效质量，m∗h为激发电子的有效质量，h为普朗克常量，e为电子电荷，ε0为真空介电常数，εr为相对介电常数，E∗Ry为里德伯能量在公式（1）中，第一项代表了未合成量子点时材料的带隙能量，第二项为量子点限域能，控制量子点发生相应的蓝移。第三项为电子-空穴对的库伦作用能，控制量子点的红移。通过Brus公式可知，这是由于当量子点体相半径比激子波尔半径小时，量子封闭性控制了空穴及电子的活动，当量子点的尺寸R逐渐增大时，库伦作用能减小的速度要远远慢于限域作用能减小速度，这时库伦作用能将会成为主项。从而使吸收峰向长波长方向运动，带隙减小，发生红移。并且图3结果表明，所制备的Ag2Se量子点在Ag∶Se为1∶1时吸收峰更为明显，由于其他配比所制备的Ag2Se量子点。

2.3 Ag2Se量子点的荧光发射特性研究

量子点价带上的电子就会发生跃迁，运动到导带空穴之中，随后再次从导带重新向价带跃迁，并在跃迁过程中发射出光子，从而产生荧光发射光谱。不同比例Ag2Se量子点荧光光谱如图4所示，通过对荧光光谱测试结果对比分析可以发现，Ag∶Se为1∶1时所制备的Ag2Se量子点荧光光谱峰值为775nm。随着Ag∶Se的改变，荧光光谱峰值分别红移至800nm、835nm及845nm。这主要是由于，随着Ag：Se比值的增大，纳米晶体中银离子含量增加，从而导致的量子点尺寸增加，导致带隙宽度逐渐变小，电子跃迁所需能量减小，因此荧光光谱峰值发生红移。且相比其他比例的Ag2Se量子点可以看出Ag∶Se比例为1∶1所制备出的量子点荧光强度要更强于其他比例。

图4 不同Ag∶Se比Ag2Se量子点荧光光谱图（1∶1，2∶1，3∶1，4∶1）

2.4 Ag2Se量子点的光学稳定性研究

如图5所示为连续6小时紫外光辐照所测得的荧光光谱，随着4种不同配比的硒化银（Ag2Se）量子点在紫外光照射下时间增加，材料光学强度变化较为明显。在0～2小时之间Ag∶Se=1∶1相对稳定，Ag∶Se=2∶1衰减幅度较大。在3～6小时之间Ag∶Se=1∶1、Ag：Se=2∶1、Ag：Se=3∶1、Ag∶Se=4∶1光学强度均下降至0。经综合考虑，0～2小时Ag∶Se=1∶1的Ag2Se量子点具有较高的光稳定性，相较于其他比例的Ag2Se量子点更具有优势。

因此，综合不同比例油性Ag2Se量子点TEM、荧光发射光谱、吸收光谱、光学稳定性等测试结果对比发现，Ag∶Se=1∶1的Ag2Se量子点分布较为均匀，分散性较好，荧光发射特性较好，光学性质最为稳定。因此，选择Ag∶Se摩尔比为1∶1的Ag2Se量子点进行表面修饰并进行生物细胞实验。

图5 不同Ag∶Se比Ag2Se量子点光学稳定图（1∶1，2∶1，3∶1，4∶1）

3 （DSPE-PEG）Ag2Se量子点物理表征

3.1 DSPE-PEG对油相Ag2Se量子点的表面修饰

为了实现该种量子点在生物体内的进一步应用，对所制备的油相Ag2Se量子点进行亲水修饰是必不可少的。由文中第二部分介绍可以得出，Ag∶Se为1∶1是所获得的油相Ag2Se量子点具有更为优异的光学特性。因此，该部分主要介绍利用DSPE-PEG对Ag∶Se为1∶1的Ag2Se量子点进行亲水性修饰及相应测试表征。

实验步骤：

将8mg/ml的Ag2Se量子点溶于1ml氯仿中和8mg/ml DSPE-PEG溶于4ml氯仿中，混合在试剂瓶中，搅拌约10min。使用旋转蒸发仪在30°C时将混合溶液挥发，得到干燥的沉淀物。溶于1.6ml去离子水，并通过0.45μm的滤膜过滤，最后得到DSPE-PEG修饰的Ag2Se量子点，保存于室温中。油性Ag2Se量子点与（DSPE-PEG）Ag2Se量子点实物图如图6所示

3.2 （DSPE-PEG）Ag2Se量子点的透射电镜表征

透射电镜是观察纳米材料形貌特征以及尺寸分布的一种必不可少的手段。如图7所示给出了转水后量子点的TEM测试结果。测试结果表明，DSPE-PEG修饰后Ag2Se量子点平均粒径为95nm，量子点聚集成团，成功“嵌套”入DSPE-PEG内部且分布均匀。高倍率下电镜结果表明量子点在DSPE-PEG内部分散度良好，呈点状分布，量子点尺寸仍保持在4nm左右。证明以成功利用DSPE-PEG对Ag2Se进行亲水修饰。

图7 （DSPE-PEG）Ag2Se量子点TEM图

3.3 （DSPE-PEG）Ag2Se量子点的吸收特性研究

利用紫外-可见近红外分光光度计对修饰前后的Ag2Se量子点进行了吸收光谱的测试，测试范围选为400～900nm，得到了如图8所示的吸收光谱图。

图8 Ag2Se量子点与（DSPE-PEG）Ag2Se量子点吸收光谱

通过光谱图可以发现，修饰后的量子点较之修饰前的量子点发生了相应的红移，且吸收强度相应减弱。而引起这种红移的可能性有两点：（1）当DSPE-PEG对Ag2Se量子点进行表面修饰时，改变了Ag2Se量子点表面的电荷分布情况，从而导致了量子点发生“红移”。（2）当DSPE-PEG对Ag2Se量子点以“嵌套”方式进行修饰时，量子点整体尺寸由于“嵌套”发生团聚而增大，结合公式（1）来看，发生了一定“红移”。

3.4 DSPE-PEG修饰前后Ag2Se量子点的荧光发射特性研究

转水后Ag2Se量子点荧光光谱测试结果如图9所示。由测试结果可以看出，转水后量子点的荧光光谱在峰值方面发生了一定“红移”，峰值从780nm“红移”至800nm。这种现象可以通过DSPE-PEG修饰前后Ag2Se量子点的荧光发射特性并结合Brus公式对其进行解释。当量子点体相半径比激子波尔半径小时，量子封闭性控制了空穴及电子的活动，随着量子点的尺寸R逐渐增大，库伦作用能减小的速度要远远慢于限域作用能减小速度，这时库伦作用能将会成为主项。DSPE-PEG修饰后的Ag2Se量子点，粒径增大从而使吸收峰向长波长方向运动，带隙减小，发生“红移”。而吸收峰的红移也导致了量子点对应的荧光光谱也发生相应“红移”。

图9 Ag2Se量子点与（DSPE-PEG）Ag2Se量子点荧光光谱图

3.5 （DSPE-PEG）Ag2Se量子点光学稳定性研究

光学稳定性是评价量子点是否具备良好光稳定性及抗光漂白性的重要参数之一。通过利用紫外光对量子点进行一定时间的连续照射并进行荧光光谱强度测试就可以很好的确定材料所具备的光学稳定性是否符合生物应用。如图10所示，给出了转水后Ag2Se量子点的光学稳定性测试结果。测试结果表明，随着转水后的Ag2Se量子点在紫外光照射时间的增加，在0～3小时内材料荧光强度下降约25%，发生了一定的光漂白效应，而3～6小时材料荧光强度则趋于平稳。整体测试结果表明，在经过6h的紫外光照射后，量子点荧光强度下降较小，证明转水后的Ag2Se量子点具有良好的光学稳定性，能够很好的应用于生物领域。

图10 （DSPE-PEG）Ag2Se量子点光学稳图

3.6 （DSPE-PEG）Ag2Se量子点的动态光散射粒径分析

动态光散射（DLS）测试分析主要是利用粒子所做的布朗运动，结合运动时所引起的光强变化，再辅以光强相关函数以此来计算出样品粒径的一种技术手段。运用这种测量手段，可以对转水后的量子点进行粒径分布的检测。测试结果如图11所示，转水后的量子点整体粒径由4nm变为100nm。这种粒径测试结果的主要原因是由于量子点是以“嵌套”方式进入DSPE-PEG当中，多个量子点发生大量团聚所导致的。

图11 （DSPE-PEG）Ag2Se量子点粒径分布图

4 Ag2Se量子点的生物细胞实验

4.1 DSPE-PEG修饰后Ag2Se量子点的胶体稳定性测试

胶体稳定性是评价量子点作为生物应用中的作为光学探针和生物成像的评价参数。通过胶体稳定性的测试可以更为直观的反映出材料在某一特定体系下的粒径变化情况。因此，本文对（DSPE-PEG）Ag2Se量子点在37°C，pH=7.2的水环境下进行了75h的胶体稳定性测试。通过对其粒径变化结果进行整理分析，得到了这种材料的胶体稳定性结果。测试结果如图12所示，由图中可以看出，DSPE-PEG修饰的Ag2Se量子点在75h的测试过程中，粒径大小变化相对稳定，除最开始的10-20h期间出现少量团聚致使材料粒径从95nm增长至125nm意外，剩余时间材料尺寸均保持在125±2nm左右，并未出现大面积团聚和降解的过程，证明转水后的量子点具有较高的胶体稳定性，可以进行生物应用。

图12 （DSPE-PEG）Ag2Se量子点胶体稳定性图

4.2 （DSPE-PEG）Ag2Se量子点在MCF-7细胞中的细胞毒性测试

量子点的毒性研究在过去的十几年中被广泛应用，以此来测试量子点对生物体的影响。这里，量子点的毒性测试选用MTT（3-（4，5-dimethylthiazol-2-yl）-2，5-diphenyltetrazolium bromide，3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四氮唑溴盐，购于sigma公司）比色分析法。MTT是一种易被水溶解和透过细胞膜而进入细胞内，可被活细胞内的琥珀酸脱氢酶还原，形成不溶于水的蓝紫色结晶的常用细胞染色物质。且该物质不与死细胞发生作用，由于结晶物形成的量与细胞数量及代谢活性成比例，因此吸光度（A）值的大小可反映细胞的数量及活性。利用MTT比色法具有特异性强、灵敏度高、快速、准确、重复性好等优势。是一种目前在生物医学领域最为常见的细胞毒性测量手段。

细胞毒性的检测采用MTT比色分析法，首先将MCF-7细胞保存于10%胎牛血清的培养基中，细胞在经过计数以后将其存放在96孔板中，且每孔细胞数大约在10000左右。在CO2培养箱中培养12h，培养环境为37oC、CO2体积分数为5%的饱和湿度，并使其贴壁生长。

随后，分别将200μL的细胞和20μL不同浓度的（DSPE-PEG）Ag2Se量子点溶液，加入96孔板中。所选量子点浓度分别为0.125mg/mL、0.25mg/mL、0.5mg/mL、1mg/mL、2mg/mL。将这几种加入不同浓度量子点的细胞培育时间设定为24小时和48小时。待培养完成后，使用酶标仪对样品进行检测并对所得数据进行整理分析，测试结果如图13所示。

图13 （DSPE-PEG）Ag2Se量子点

如图13所示结果可以看出，MCF-7细胞在加注裁量并分别进行24小时和48小时培养后，随着量子点溶液浓度的升高细胞活性呈现下降的趋势。其中，在材料浓度为0.5mg/mL及以下时，细胞活性在24、48h内均保持在80%以上。而材料浓度增加为2mg/mL时，细胞活性仍维持在75%。证明转水后的Ag2Se量子点具有良好的生物兼容性和较低的生物毒性。适合应用于生物领域作为荧光标记物对生物体进行荧光标记。

5 结论

本论文通过油相合成法对近红外荧光量子点硒化银（Ag2Se）进行制备，通过改变反应中Ag、Se配比的方式，获得了荧光光谱范围在780-840nm的不同尺寸的Ag2Se量子点并对其进行相应物理表征。通过对表征结果进行对比分析，发现Ag：Se为1：1时所制得的Ag2Se荧光强度更为优异的同时具有良好的光学稳定性。随后，利用DSPE-PEG对Ag2Se量子点进行表面修饰，使其具有亲水性并对其进行相应稳定性测试。测试结果表明，转水后的量子点稳定性良好。而后的生物毒性24、48h测试结果结果表明，该种量子点的生物毒性较低，细胞活性经48h培养均保持在75%以上，证明此种量子点具有良好的生物兼容性。综上所述，Ag2Se量子点作为一种新型近红外荧光量子点，将其应用于生物领域进行生物荧光标记是切实可行的。本论文的实验结果将对这种材料在生物领域的应用提供可靠的实验依据。

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