基于UPLC-TQ MS的丹七软胶囊中8种活性成分的溶出度考察

庞 颖，杨 健，高 峰＊

（1.中国中医科学院西苑医院 北京 100091;2.中国中医科学院中药研究所 北京 100700）

丹七软胶囊功效为，活血化瘀，通脉止痛。用于瘀血闭阻所致的血瘀证和胸痹，症见胸部刺痛、痛处固定、眩晕头痛、经期腹痛[1-5]。主要由丹参、三七提取物组成。丹参的主要活性成分为酚酸类及丹参酮类物质；而三七的主要活性成分为三七皂苷。中药具有多组分作用于多靶点实现中药整体作用的特点，不同性质的活性成分溶出可能不具有同步性[6-8]。

液相色谱-质谱联用作为一种高效互补的分离鉴定技术，具有灵敏度高、结果准确等特点因而得到广泛应用。三重四极杆质谱仪的多反应监测模式（Multiple reaction monitoring，MRM）可以对选定的特异离子对进行质谱信号的采集，通过两级离子选择，排除大量干扰离子，使质谱的化学背景降低，大大的提高了定量分析中的灵敏度、重现性与准确度[9,10]。本文采用快速、高灵敏度、高选择性的UPLC-TQ MS技术，同时考察丹七软胶囊中的8种不同类型化合物的溶出规律。

1 材料与方法

1.1 仪器

超高效液相色谱仪（UPLC，美国Waters公司）；串联API 5500三重四极杆质谱仪（美国Applied Biosystems公司），配备Waters UPLC自动进样器，柱温箱，数据采集由Analyst软件完成。RCZ-8B溶出试验仪（天津市天大天发科技有限公司）。

1.2 试药

丹酚酸 B（111562-200202，纯度97%），迷迭香酸（111871-201505，纯度98%），丹参素（110855-200902，纯度98%），三七皂苷R1（110745-200905，纯度95%），人参皂苷Rb1（110704-200602，纯度94%），人参皂苷Rg1（110703-200405，纯度95.0%）对照品购自中国药品生物制品检定所；丹酚酸 A（SH-A0055，纯度98.0%），鼠尾草酸（SH-1096746，纯度98.0%）购自北京万佳首化生物科技有限公司。

表1 UPLC-TQ MS参数优化表

丹七软胶囊（美纳达）（批号：15010110、15030113、15050112）由北京长城制药厂生产，均购自金象大药房（西单店）。

1.3 色谱条件

不同的目标化合物用不同的液相与质谱方法检测：

丹参酚酸类化合物色谱条件（Meth1）：色谱柱：Waters Acquity HSS T3 column（100×2.1 mm,1.8 μm）；进样量：1 μL；流速：0.6 mL·min-1；柱温：30℃；流动相：A.水/甲酸（99.9∶0.1，V/V），B.乙腈（99.9∶0.1，V/V）；洗脱程序为：20-30%B(0-1.5 min)，30-90%B(1.5-2.0 min)，90%B(2.0-3.0 min)，90-20%B(3.0-3.5 min)，20%B(3.5-5.0 min)。

三七皂苷类化合物色谱条件（Meth2）：色谱柱：Waters Acquity HSS T3 column（100×2.1 mm,1.8 μm）；进样量：1 μL；流速：0.4 mL·min-1；柱温：30℃；流动相：A.水/甲酸（99.9∶0.1，V/V），B.乙腈（99.9∶0.1，V/V）；洗脱程序为：10-60%B(0-7.0 min)，60-10%B(7.0-7.5 min),10%B(7.5-9.0 min)。

1.4 质谱条件

为了提高选择性和特异性，采用MRM模式进行丹七软胶囊中活性成分的分析。丹参酚酸类成分在Low Mass负离子模式下检测；三七皂苷类成分在High Mass负离子模式下检测。去簇电压（DP），入口电压（EP），碰撞能量（CE），碰撞室出口电压（CXP）等重要参数都经过较好的优化并列于表1中。

1.5 溶出度的条件及测定

文献[11]中优化了复方丹参片溶出度研究条件。复方丹参片中5种活性成分的溶出度比较,参照《中国药典》2005年版二部溶出度测定法第二法进行溶出试验。量取900 mL经脱气处理的溶出介质（1%SDS水溶液），加热使介质温度升至并保持于（37±0.5）℃，取6粒丹七软胶囊（批号：15010110），每个转篮中投入1粒，共6个重复，转速100 r·min-1进行试验，于1、5、10、20、30、45、60、70、90 min定时、定点取样2 mL，同时补加同温等量的同种介质，样品中加甲醇至4 mL，摇匀过0.22 μm PTFE滤膜，取续滤液，UPLC-TQ MS法进样1 μL，测定目标化合物的含量，计算目标物的累积溶出度。

“文明素养”示范。采用推荐和寻访相结合的方法，在全市范围大力实施“万千百”工程。展示“万家文明风”。在全市各主要媒体开辟专栏，发掘、推出家庭文明新事，用凡人小事打动人，用身边事引领身边人，将发动的过程变为再教育的过程，以此带动全社会风气的不断好转。选树“千人公德榜”。在新闻媒体、大型户外媒体等设立“千人公德榜”，及时宣传弘扬社会公德的典型，汇聚点滴“善小”，形成强大的道德正能量。上好“百堂道德课”。利用“万家文明风”展示和“千人公德榜”设立的契机，广泛收集身边典型人物的典型事迹，使之成为全市道德教育的生动教材。

2 结果与分析

2.1 分析方法的建立与优化

为了更加准确快速的检测丹七软胶囊中的活性成分，分别针对不同性质的化合物建立了相应的UPLCTQ MS分析条件。丹七软胶囊内容物样品分析总离子流图（图1）中，丹酚酸A、丹酚酸B、迷迭香酸、丹参素、鼠尾草酸、三七皂苷R1、人参皂苷Rb1及人参皂苷Rg1在相对应的色谱分析条件下的出峰时间分别为1.28、1.61、1.77、0.84、2.89 min（Meth1）；3.22、4.40、4.81 min（Meth2）。两种检测方法的分析时间分别为5.0、9.0 min，各检测目标化合物峰没有杂质干扰，峰型较好，系统适用性实验结果表明，仪器条件符合要求。

2.2 方法学确证

2.2.1 标准曲线的绘制

分别精密称定丹酚酸A，丹酚酸B，迷迭香酸，丹参素，鼠尾草酸，三七皂苷R1，人参皂苷Rb1，人参皂苷Rg1，50%甲醇超声波辅助溶解并放冷稀释，制得上述对照品浓度分别为0.51、0.60、0.49、0.58、0.35、0.65、0.45、0.59 mg·mL-1贮备液。精密量取一系列体积的贮备液至10 mL量瓶中，加50%甲醇超声辅助溶解并稀释至刻度，得到各对照品系列标准溶液。在相应的UPLC-TQ MS分析方法下进样1 μL，记录色谱峰面积，以对照品浓度（c）为横坐标，峰面积（A）为纵坐标做图，制得各对照品标准曲线。

图1 丹七软胶囊中活性成分的UPLC-TQ MS分析

各目标化合物的标准曲线在相应的线性范围内线性良好（r2＞0.9990）。丹酚酸A：Y=585745X+21103（r2=0.9997），丹酚酸 B：Y=1,286,559.81X+607,506.21（r2=0.9998），迷迭香酸：Y=135022X+6.5×107（r2=0.9996），丹参素：Y=232802X+18119（r2=0.9999），鼠尾草酸：Y=1.1×107X+3.5×106（r2=0.9993），三七皂苷R1：Y=6356.3X+21348（r2=0.9992），人参皂苷Rb1：Y=3925.2X+4537（r2=0.9991），人参皂苷Rg1：Y=3852.5X+54761（r2=0.9995）。

2.2.2 精密度实验

2.2.3 加样回收率实验

精密称取0.2 g已知含量的软胶囊内容物，共9份，分成3组，分别精密加入高、中、低浓度的对照品溶液，计算加样回收率。如表2显示，丹酚酸A，丹酚酸B，迷迭香酸，丹参素，鼠尾草酸，三七皂苷R1，人参皂苷Rb1，人参皂苷Rg1的回收率分别为101.1、99.5、98.2、98.8、98.4，102.1、101.5、100.1%，RSD 分别为 0.71、0.78、0.66、0.82、0.81、0.91、0.62、0.76%，结果表明了方法的准确度良好。

2.2.4 稳定性实验

取一定量已知含量的软胶囊内容物，溶解于50%甲醇溶液中，分别在 0、2、4、8、10、12、24 h过0.22 μmPTFE滤膜后，相应的UPLC-TQ MS分析方法进样1 μL，记录色谱峰面积，稳定性由RSD表示。样品制备24 h内，检测丹酚酸A，丹酚酸B，迷迭香酸，丹参素，鼠尾草酸，三七皂苷R1，人参皂苷Rb1，人参皂苷Rg1 的 RSD 分别为 0.61、0.72、0.57、0.62、0.78、0.84、0.48、0.79%，表明方法在24 h内具有较好的稳定性。

表2 加样回收率实验结果

图2 丹七软胶囊累积溶出度曲线

2.2.5 重复性实验

取同一批丹七软胶囊，取出内容物，按文献中方法分别制备丹七软胶囊的水溶性及脂溶性供试品溶液各6份，测定峰面积，由RSD表示重复性。丹酚酸A，丹酚酸B，迷迭香酸，丹参素，鼠尾草酸，三七皂苷R1，人参皂苷Rb1，人参皂苷Rg1的RSD分别为0.18、0.45、0.38、0.72、0.59、0.79、0.66、0.56%。表明方法的重复性较好。

2.3 溶出度的测定

以时间为横坐标，累积溶出度为纵坐标，绘制溶出曲线，结果如图2所示。丹七软胶囊中活性成分特别是水溶性活性成分溶出较快，30 min时丹参中的丹酚酸A、丹酚酸B、迷迭香酸、丹参素、鼠尾草酸等酚酸类成分和三七中的三七皂苷类即可达到最大的溶出（90%以上），体外溶出较快。

以丹参素和人参皂苷Rg1为指标性成分，分别对丹七软胶囊的溶出均一性和溶出重现性试验进行的考察。取丹七软胶囊（批号：15010110）6粒，按所建立的溶出度测定方法进行丹七软胶囊溶出均一性试验，溶出曲线见图3。结果表明，丹七软胶囊的溶出均一性良好；取3批丹七软胶囊样品（批号：15010110、15030113、15050112），按所建立的溶出度测定方法进行溶出重现性试验。溶出曲线见图4，结果表明3批丹七软胶囊的溶出重复性良好。

3 讨论

图3 丹七软胶囊溶出均一性考察

图4 丹七软胶囊溶出重复性考察

本文建立了基于UPLC-TQ MS的丹七软胶囊中8种主要活性成分的溶出度的考察方法。包括5个丹酚酸类物质（丹酚酸A、丹酚酸B、迷迭香酸、丹参素、鼠尾草酸），3个三七皂苷类（三七皂苷R1、人参皂苷Rb1、人参皂苷Rg1），且方法的准确度、精密度、重复性和稳定性均符合检测要求。本研究结果显示丹七软胶囊中活性成分特别是水溶性活性成分溶出较快，30 min时丹参中的酚酸类成分和三七中的三七皂苷类即可达到最大的溶出（90%以上）说明其体外溶出快，具有溶出均一性。

在一定程度上，体外溶出试验能够预测药物在体内的溶出状况，药物溶出度的测定是证明体内药物释放的一种严谨而有效的实验室检测方法[12-14]。由于中药复方制剂成分复杂、有效成分较多，因此对其的溶出度研究更为重要。

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