使用结扎法建立大鼠经脉不通病理模型的初步研究❋

黄 琰，王燕平，张维波，贾术永，李宏彦，王 泽，叶丰瑶，王广军，田宇瑛

(1. 北京中医药大学，北京 100029； 2. 中国中医科学院，北京 100700)

中医基础研究常需建立各种动物模型，其中证候模型是一个重要方面。陈小野曾对脾虚证、肾虚证等模型进行过系统研究[1-2]，并总结撰著了《实用中医证候动物模型学》[3]。《灵枢·经别》指出：“夫十二经脉者，人之所以生，病之所以成，人之所以治，病之所以起”，认为经脉是疾病形成及治疗的关键。经脉病候是中医最早总结出来的证候模型之一，但相关的动物模型研究较少。《灵枢·刺节真邪》指出：“一经上实下虚而不通者，此必有横络盛加于大经，令之不通。”经脉不通是中医病机理论中重要的发病机制，相当于现代医学的病理学层面。研究经脉的病理作用常采用阻断经脉的方法，即制造“经脉不通”的病理模型。1997年张维波提出了经络的低流阻组织液通道学说，并发现了循经低流阻通道[4]，随后又对凝胶堵塞建立的经脉不通病理模型进行了一系列研究[5-7]。现在常用的经脉阻断方法有注射胰酶[8]、机械压迫[9]、切断经脉沿线脂肪带[10]以及注射水凝胶[5]等。注射胰酶、机械压迫均未见形成稳定的经脉不通模型，且阻断时间有限；切断经脉沿线脂肪带可阻断针刺镇痛效应，但对其阻断效应的延续时间尚未作进一步研究，且皮下脂肪可能随时间推移囤积而影响阻断效果；凝胶注射效果较好，可形成较稳定的经脉不通模型，但凝胶注射到体内后，如果时间较长，仍会有部分发生吸收和扩散，特别是下肢部活动较多的地方。因此，建立一种更稳定的经脉不通病理模型在经络研究中尤为重要。

1 材料与方法

1.1 实验材料

清洁级雄性SD大鼠，体质量200～260 g，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供。医用缝合针(规格01/2 5×12)、医用丝线(S26，No.4)，异氟烷(河北一品制药有限公司生产)用于动物麻醉。5726F30 经络测定仪(东华电子仪器厂)、生物流阻/组织液压测量仪(自行研制)、配套小动物麻醉机(Matrx VMR，美国MIDMARK集团)。

1.2 实验方法

1.2.1 动物分组及前期准备 按随机数字表法将大鼠分为结扎1组、结扎2组、结扎3组、结扎4组各12只共48只。用脱毛剂进行脱毛处理，适应性饲养2 d后进入实验，实验前大鼠禁食2 h。将大鼠放入麻醉机诱导盒内通入浓度为2%的异氟烷混合氧(异氟烷与氧气的混合气体)诱导吸入麻醉后，取出并使用面罩持续以浓度为1%～2%的异氟烷混合氧吸入维持麻醉。

1.2.2 任脉低电阻线的测量 大鼠麻醉后固定，使用5726F30经络测定仪，铜板电极连接大鼠尾部任意一处，铜笔电极在腹部任脉区域(腹部正中线区域)的皮肤表面进行缓慢、轻柔的测量(方向与任脉垂直)；当仪表盘显示有较大电流通过时，用红色记号笔标记为低电阻点，测5～10个低电阻点，间距0.5～1 cm，所测低电阻点连成的平滑曲线即任脉的低电阻线，代表任脉的定位，简称任脉线。

1.2.3 组织液压波的测量 图1显示，在腹部任脉线上选取长4～5 cm的一段作为测量区，分别将近心端和远心端标记为A点和B点。用测量组织液波压传播法[11]测量任脉线的组织液压波传播。具体操作如下：使用生物流阻/组织液压测量仪，将由带侧孔6号注射器针头制作的测试针头向心方向由B点插入大鼠任脉皮下，使侧孔位于距B点1 cm处的任脉线皮下，用安固特胶将针头固定于皮肤，该针头用于测量组织液压波的传播；用2 ml注射器由与任脉垂直方向从A点旁开1 cm处插入皮下至A点，在A点注入生理盐水形成人工丘泡。从注射器迅速注入0.1 ml的生理盐水到任脉组织中，形成一个小丘泡，然后立刻在丘泡上施加一个50 g的砝码，砝码放在20 ml的注射针管内保持与皮肤垂直，施加后在丘泡部位形成压力波，同时测量任脉线上B点的组织液压变化，采集5.5 s的压力数据；测试针头连接传感器的组织液压信号经仪器放大后，由计算机的A/D电路采集，采集速率0.1375 s，采集后做成文件储存。将施加砝码前后的组织液压平均值的差值作为组织液压波的传播幅度[5, 11]。

图1 大鼠经脉结扎对组织液压波传导影响实验示意图注：EV.电磁阀；P.压力传感器；N1.测试针；N2.注射针；B点.测试针头插入点；A点.皮丘注射点；a.经上结扎处；b.经外结扎处

1.2.4 经脉结扎方法 图2显示，结扎1组在A、B点之间选1个点，以任脉线为中心，左/右各取5 mm/5 mm作为结扎进针点和出针点；结扎2组在A、B点之间选2个点，两点之间间隔1～2 mm，以任脉线为中心，左/右分别取4 mm/6 mm和6 mm/4 mm作为结扎进针点和出针点；结扎3组在A、B点之间选3个点，三点之间分别间隔1～2 mm，以任脉线为中心，左/右分别取4 mm/6 mm、5 mm/5 mm和6 mm/4 mm作为结扎进针点和出针点；结扎4组在A、B点之间、任脉线旁开1 cm、2 cm处各选1个点作为结扎进针点和出针点。各组进针点和出针点的连线均与任脉线方向垂直。为避免结扎时进出针拉扯对实验造成的干扰，各组均在测量前先将结扎线按各组进出针点穿好再进行任脉线的组织液压波传播幅度的测量，然后再采用各组结扎方法。具体方法如下：用缝合针(规格01/2 5×12)穿过进针点皮肤，穿过其皮下肌肉，从出针点穿出，用4号丝线将所选部位皮肤与其皮下肌肉紧密结扎在一起，结扎宽度为1 cm。

图2 大鼠结扎后的即刻解剖观察注：箭头为结扎处丝线

1.2.5 结扎后组织液压波的测量与指标计算方法 各组结扎完成后，再次用同样的方法测得结扎后任脉线的组织液压力传播幅度。分别计算结扎前施加压力后和施加压力前的液压差的绝对值、结扎后施加压力后和施加压力前的液压差的绝对值，取两者平均值得出各组在结扎前后的压力幅度并计算变化率，变化率计算公式为：变化率=(结扎后压力幅度-结扎前压力幅度)/结扎前压力幅度。

2 结果

2.1 组织液压波传播的变化

表1图3显示，4组大鼠实验的结果。

表1 结扎对任脉线压力波传播幅度的影响

注：与结扎前比较:**P<0.01

图3 结扎前后任脉组织液压波传播幅度变化率

图4显示，在经脉外结扎，其组织液压波传导幅度有所增加，在任脉线上结扎其传导幅度下降，并随着结扎点的增多下降幅度增大，结扎3个点的下降幅度与结扎前比较差异有统计学意义。

图4 任脉线外与线上结扎的组织液压波变化注：(1)任脉外结扎前后压力变化；(2)任脉线上结扎3个点前后的压力变化；a.结扎前施加砝码前的压力；b.结扎前施加砝码后的压力；c.结扎后施加砝码前的压力；d.结扎后施加砝码后的压力

2.2 结扎8周后的组织结构变化

图5显示，对20只大鼠进行结扎后的长期饲养，于8周后解剖观察发现，结扎部位皮肤与肌肉紧密黏连。

图5 大鼠任脉结扎后8周的解剖观察注：a.皮肤与皮下肌肉之间出现明显黏连，箭头为缝合线头大鼠啃噬机化后的遗留物；b.将结扎处皮肤拉起后皮下肌肉被同时牵拉形成的条索物(箭头所示)

3 讨论

本实验使用组织液压波传播法测量结扎阻断经脉的效果。由于组织液压波有一定的绕行能力，用一定宽度的结扎难以完全阻断其传导，而为了特异地阻断某条经脉又不能结扎得太宽，故采用一定间隔的多部位结扎方法，该法也曾在坐骨神经的结扎实验中使用[12]。表1图3可知，在任脉线旁开的部位结扎，不能使压力传导减弱，反而有所增加，而在任脉线上结扎可导致压力传导下降，说明任脉是一条连续的、可传导组织液压波的组织液通道，在任脉外结扎对其传导影响较小。由于压力波的扩散性，在经外阻断可导致压力波更多地向经脉传递，使经上的传导幅度增大，可解释结扎4组的正向变化率，可能是由于操作及个体差异，导致标准差较大而未达到显著性变化。

比较在经脉上结扎1点、2点和3点的效果发现，其压力波下降的幅度逐渐增加，说明结扎的数量对结扎效果有明显影响，结扎3个点之后，压力波出现了极显著减小(P<0.01)，产生了预期的阻断效果，说明以1 cm结扎宽度、相隔1～2 mm结扎三处可有效阻断经脉中组织液压波的传导，结扎导致组织间隙结构的改变，使组织液压波无法传播，与血管结扎时血管间隙变小、血流减少相类似，且可长时间保持该状态，为建立经脉不通模型提供了重要的建模数据。

生物结构的功能研究常使用阻断方法，观察阻断前后某个组织或器官的生理活动变化。经脉作为中医理论认定的一种具有传输性质的生理学结构，对其功能的研究也可借鉴该方法。经脉不通本来就是经络的一个病理状态，如何人工可控的制造这一状态是经络研究的一个关键技术。本团队于2009年建立了凝胶注射阻断经脉的方法，并用组织液压波传播的方法证明当注射的凝胶量大于0.5 ml时，可有效阻断经脉低流阻通道的传导[5]，该方法可长期阻断经脉并产生相应的病理表现，如胃经、肾经不通小型猪在大小便、体尺、牙齿尺寸等宏观指标上表现出变化及差异[7]；胃经不通小型猪在胃肠状态方面出现不同程度的胀气[6]，在行为方面出现夜间活动及爬栏次数增多等烦躁不安的表现[13]；小型猪阻断经脉后出现持续性痛阈改变[14]。但凝胶有一定流动性，解剖时发现注射的凝胶在腿部有部分扩散，一定程度上减弱了阻断的效果。

血管结扎法已在临床研究与动物实验中广泛使用，如冠脉结扎制备心肌梗死模型[15]等，而表浅部位的血管结扎对全身影响较小。而循经低流阻通道主要位于皮肤与肌肉之间的皮下疏松结缔组织构成的间隙，采用一定宽度的线结扎法使该结构变窄乃至封闭后，不影响其他组织的活动，因此本实验尝试采用结扎法作为阻断技术。该方法使用医用缝合线，与组织有一定的相容度，且不易被组织吸收也不会扩散，仅导致组织间隙的减小，对其他组织如神经和血管基本无大影响。8周后的解剖观察表明，持续的慢性结扎进一步导致结扎部位皮肤与肌肉的紧密黏连，加强了经脉不通的病理效应，与中医临床所见的慢性疼痛病灶点即局限性无菌性炎症的组织黏连变化有一定的相似性[16]。

大鼠是医学实验最常用的动物模型，由于其皮下组织疏松、易滑动进行低流阻通道的测量有一定难度，在小型猪上使用的凝胶注射法难以移植到大鼠上，使得一些观察如使用旷场仪的动物行为学研究难以进行，但大鼠可测量循经低电阻线。以往研究发现，小型猪的循经低流阻通道与循经低电阻线基本重合[4]，又对组织液压波沿大鼠任脉低流阻点的传播特性进行了研究[11]，证明其方法学的可行性。因此本实验利用循经低电阻线代替循经低流阻通道的位置，这两者的平均距离在小型猪上为1.5 mm[4]，小型猪和大鼠同属于哺乳类动物，在大鼠上的距离会更小，而结扎的宽度为10 mm，故完全可以阻断大鼠的低流阻通道。本研究首次使用结扎法在大鼠上建立经脉不通的病理模型，使得未来的经络病理学研究可在最常用的大鼠上进行，大大扩充经络病理学研究的范围。

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