红曲百合蜂蜜酒酿造工艺的优化

邓加聪，蒋素素，王诗瑶，王志辉 ，张文森，郑 虹

(1.福建师范大学福清分校海洋与生化工程学院，福建福清350300；2.食品软塑包装技术福建省高校工程研究中心，福建福清350300)

蜂蜜是蜜蜂采集植物的花蜜、分泌物或蜜露,与自身分泌物结合后,经充分酿造而成的天然甜物质[1]。它是一种高度复杂的糖类溶液，含有微量元素、氨基酸、蛋白质、有机酸、维生素、胶质物、蜂花粉和激素等[2]，具有很高的营养价值和保健作用[3]。

百合是一种多年生宿根草本植物，而用百合酿造的酒是一种具有营养、保健、食疗等功能的新型饮品[4]，现代医学研究发现，百合除含有蛋白质、脂肪、还原糖及矿物质外，还含有一些特殊的营养成分，如多种生物碱、糖苷、皂苷、酚酸甘油酯及丙酸酯衍生物等多种物质[5-6]。这些成分对人体不仅具有较好的滋补功效，而且还具有抗癌、抗疲劳、抗氧化、抗过敏等药理作用[7-10]。

红曲的主要活性成分为麦角甾醇、洛伐他汀、豆甾醇和莫纳克林[11-12]。这些活性物质具有降血糖、降血脂、降血压等功效，因此在酿酒的过程中添加红曲,使酒中溶入红曲所富含的多种活性物质，进而使酒有一定的营养和保健功能[13-14]。

蜂蜜酒是稀释后的蜂蜜经酵母菌发酵后酿制而成。蜂蜜中富含果糖，具有较高的渗透压，使微生物在此中难以生长繁殖[15-16]。稀释后的蜂蜜，糖分降低，适合酵母菌生长繁殖和发酵。目前蜂蜜酒产业成为地方产业发展、农民增收的一个特色传统产业项目。但就传统工艺而言，配方因人而异，加工设备简陋，家庭作坊式生产繁琐耗时，导致加工工艺不规范，工艺参数模糊。同时蜂蜜酒发酵过程中由于营养物的限制，存在发酵速度慢、酒精度低、残糖量高等问题,制约了蜂蜜酒的发展，为改善这一重大问题，本项目对蜂蜜酒酿造工艺进行研究与改造创新。

1 材料与方法

1.1 材料及试剂

蜂蜜，南平百花酒业有限公司；红曲，古田县力发曲业有限责任公司；百合干，市售；安琪酵母（耐高糖）、安琪酵母（黄酒专用）、生香酵母，安琪酵母股份有限公司；果胶酶（6000 U/mL）、黄酒澄清剂、磷酸二氢钾、硫酸铵、硫酸铜、次甲基蓝、酒石酸钾钠、亚铁氰化钾、盐酸、无水葡萄糖、氢氧化钠、甲基红等试剂均为分析纯，购自国药集团有限公司。

1.2 主要仪器

酒坛，市售；WYT-4手持式糖量计，泉州中友光学仪器有限公司；酒精计，上海科学仪器有限公司；PHS-3E酸度计，上海仪电科学仪器股份有限公司；FW100高速万能粉碎机，天津市泰斯特仪器有限公司；DK-98-(II)电子调温万能电炉，天津市泰斯特仪器有限公司；DHG-9076A电热恒温鼓风干燥箱，上海精宏实验设备有限公司；SPX-150B-Z生化培养箱，厦门精益兴业科技有限公司；YP402N电子天平，上海精密科学仪器有限公司；蒸馏器等玻璃仪器，福州玻璃仪器有限公司。

1.3 百合酶解工艺条件的研究

1.3.1 百合酶解的工艺流程

1.3.2 操作要点

（1）百合干的预处理：选用无霉变、无虫蛀的百合干，粉碎机磨成粉末，60目过筛备用。

（2）酶解：取一定量百合干粉，用水溶解（百合干粉∶水=1∶20），用1 mol/L盐酸将pH值调至4.5±0.5，加果胶酶，50℃下酶解60 min。

（3）灭酶：将百合酶解浆液在100℃下保温3～5 min，灭酶活。

1.3.3 酶解工艺优化

（1）不同果胶酶添加量对百合酶解效果的影响准确称取5 g百合粉，加入100 mL的蒸馏水，经糊化、冷却，调酸至pH4.5±0.5，分别加入果胶酶（酶活活力为60 U/mL）1 mL、2 mL、3 mL、4 mL、5 mL、6 mL，于50℃下酶解60 min，灭酶后自然冷却至室温，用分光光度计测定并计算百合酶解浆液中皂苷的含量。每组试验做3个平行。

（2）不同温度对百合酶解效果的影响

准确称取5 g百合粉，加入100 mL的蒸馏水,经糊化、冷却，调酸至pH4.5±0.5，加入4 mL果胶酶（酶活活力为60 U/mL），不同温度（35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃）下酶解60 min，灭酶自然冷却至室温待测，测定后计算皂苷含量。每组试验做3个平行。

（3）不同酶解时间对百合酶解效果的影响

准确称取5 g百合粉，加入100 mL蒸馏水，经糊化、冷却，调酸至pH4.5±0.5，添加4 mL果胶酶（酶活活力为60U/mL），45℃下分别以30min、60min、90 min、120 min、150 min、180 min进行酶解，灭酶自然冷却至室温待测，测定后计算皂苷含量。每组试验做3个平行。

（4）3因素3水平试验优化酶解工艺

根据单因素试验结果，采用果胶酶的添加量、酶解温度、酶解时间作为考察因素，选用L9(34)正交表进行试验分析，测定吸光度后计算皂苷含量。百合酶解的因素和水平表见表1。

表1 百合酶解工艺的因素和水平

1.4 百合蜂蜜酒发酵工艺条件的研究

1.4.1 百合蜂蜜酒发酵的工艺流程

1.4.2 操作要点

（1）蜂蜜的稀释

按蜂蜜∶水=1∶4进行配比，添加20%百合酶解液，调配成糖度为25～26°Bx百合蜂蜜水溶液。

（2）加热灭菌

将调配好的百合蜂蜜水溶液于100℃下保温30 min，冷却至室温。

（3）酵母活化

称取一定量的安琪酵母接种于质量分数为3%的蜂蜜水，35～37℃活化培养1 h。

（4）菌种扩培

将活化后的酵母菌接种于新鲜的培养基，扩培4.5倍，当发酵液产生大量气泡时，扩培结束。

（5）接种

将扩培液与灭菌后的百合蜂蜜水在酒坛中混匀，并接入适量的红曲与百合酶解液。

（6）发酵

24～26℃发酵培养10～15 d。达到发酵终点时，75℃下保温10 min，冷却至室温。

（7）压榨过滤

发酵液用200目的尼龙绢布压榨过滤。

（8）澄清、过滤

压榨后的酒液中加入0.3%的黄酒专用澄清剂，混合均匀后静置沉淀12 h，上清液经硅藻土过滤至清亮透明。

（9）灌装、杀菌

酒液灌装封口后，80℃下保温30 min，杀菌后冷却至室温。

1.4.3 酿造工艺优化

（1）酵母菌种的选择对红曲百合蜂蜜酒品质的影响

3种酵母按以下3种不同组合：①生香酵母+安琪酵母（黄酒专用）、②安琪酵母（耐高糖）+生香酵母、③安琪酵母（耐高糖）+安琪酵母（黄酒专用）+生香酵母，接种于百合蜂蜜混合液，加入3%红曲，30℃发酵5 d。对发酵后的产品进行感官评价。

（2）初始糖度对红曲百合蜂蜜酒品质的影响

3种酵母混合，以0.6%接种量接种于不同初始糖度（20 °Bx、22 °Bx、24 °Bx、26 °Bx、28 °Bx、30 °Bx）的百合蜂蜜混合液，添加3%红曲。对发酵后的产品进行感官评分。

（3）百合酶解液添加量对红曲百合蜂蜜酒品质的影响

3种酵母混合，以0.6%接种量接种于初始糖度为26°Bx的不同量（10%、15%、20%、25%、30%、35%）的百合蜂蜜混合液，加入3%红曲。对发酵后的产品进行感官评分。

（4）酵母接种量对红曲百合蜂蜜酒品质的影响

3种酵母混合，以不同接种量（0.38%、0.41%、0.51%、0.55%、0.66%、0.74%）接种于初始糖度为26°Bx的25%的百合蜂蜜混合液，加入3%红曲。对发酵后的产品进行感官评分。

（5）红曲添加量对红曲百合蜂蜜酒品质的影响

3种酵母混合，以0.66%接种量接种于初始糖度为26°Bx的25%的百合蜂蜜混合液，加入不同量（1%、2%、3%、4%、5%、6%）的红曲。对发酵后的产品进行感官评分。

（6）正交试验优化红曲百合蜂蜜酒酿造工艺

根据单因素试验结果，采用蜂蜜水初始糖度、百合酶解液添加量、酵母接种量、红曲添加量作为考察因素，进行蜂蜜酒酿造的正交实验设计。因素和水平见表2。

表2 酿造工艺的因素和水平

1.5 分析方法

1.5.1 溶液中皂苷含量的测定

（1）D101树脂的预处理

称取50 g树脂浸泡在丙酮中，浸泡24 h，50℃水浴加热回流18 h，抽滤后丙酮冲洗，再用蒸馏水冲洗，最后与蒸馏水按1∶2混合，备用。

（2）层析柱的制备

采用湿法装柱（Ø：1 cm，D：15 cm），树脂高度为5 cm，之后覆盖少量脱脂棉，再加入0.2 g中性氧化铝，最后覆盖1层脱脂棉并压紧，备用。

（3）样品百合总皂苷含量的测定

称取2 mL百合皂苷提取液于10 mL容量瓶中，溶剂自然挥发后，用蒸馏水溶解并定容。取5 mL上述溶液，移入备用层析柱（流速控制在0.5 mL/min），用15 mL蒸馏水冲洗，洗去未吸附的杂质，再用30 mL 70%乙醇洗脱，收集洗脱液。测定并计算洗脱液中皂苷的含量[6，17]。

（4）标准曲线的制备

称取干燥后的人参皂苷Re标准品20 mg于5 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容。取5个10 mL具塞试管，分别加入30 μL、60 μL、90 μL、120 μL、150 μL的4 mg/mL人参皂苷Re，自然挥发除去甲醇，依次加入0.2 mL 5%香草醛冰醋酸溶液（现配现用）和0.8 mL高氯酸，混匀后，60℃水浴保温15 min，之后冰水冷却5 min，以不添加人参皂苷的试剂作为空白参比，552 nm处测定吸光度。以人参皂苷浓度（mg/mL）为横坐标，以OD值为纵坐标，绘制标准曲线。标准曲线见图1，得回归方程y=0.9749x-0.091，R²=0.9993。

1.5.2 可溶性物的含量测定

图1 人参皂苷标准曲线

采用手持式折光仪进行测定。

1.5.3 总糖的测定

按GB/T 13662—2008中6.2.2规定执行。

1.5.4 总酸的测定

按GB/T 13662—2008中6.6规定执行。

1.5.5 pH的测定

按GB/T 13662—2008中6.5规定执行。

1.5.6 酒精度的测定

按GB/T 13662—2008中6.4规定执行。

1.6 红曲百合蜂蜜酒感官评价的方法

根据红曲百合蜂蜜酒的色泽、气味、外观、口感进行感官评分，样品随机提供给10位经培训人员品尝和鉴定，红曲百合蜂蜜酒的感官评价标准见表3。

2 结果与分析

2.1 百合酶解工艺的研究

表3 红曲百合蜂蜜酒的感官评价标准

2.1.1 不同果胶酶的添加量对百合酶解效果的影响（图2）

图2 不同果胶酶添加量对百合浆液酶解效果的影响

由图2可知，随着果胶酶添加量的增加，糊化后的百合浆液中皂苷的含量也随之逐渐增加，表明果胶酶对百合浆液的酶解效果逐渐增强；当浆液中果胶酶添加量为240 U/mL时，百合浆液中皂苷的含量达到最高，为0.422 mg/mL，说明此时果胶酶对百合浆液的酶解效果最佳；之后，随着果胶酶添加量的增加，百合浆液的皂苷含量反而降低，表明果胶酶对百合浆液的酶解效果反而降低。当百合浆液中果胶酶的浓度过高，底物浓度过低，会造成酶的过量，同时添加过量的果胶酶，会产生异味，进而影响百合蜂蜜酒的口感。所以果胶酶的添加量取240 U/mL。

2.1.2 不同酶解温度对百合浆液酶解效果的影响（图3）

图3 不同酶解温度对百合酶解效果的影响

由图3可知，当酶解温度为35～45℃时，随着酶解温度的升高，百合浆液与果胶酶充分接触，百合浆液中皂苷总量逐渐增加，酶解效果逐渐增强；当酶解温度为45℃时，百合浆液的酶解效果最佳；当酶解温度超过45℃时，随着酶解温度的升高，百合浆液的酶解效果反而下降。所以确定酶解温度为45℃。

2.1.3 不同酶解时间对百合浆液酶解效果的影响（图4）

图4 不同的酶解时间对百合酶解效果的影响

由图4可知，随着酶解时间的增加，百合酶解浆液的皂苷含量先增加后缓慢下降。是因为随着酶解时间的延长，糊化好的百合浆液逐渐被酶解；当酶解时间达到90 min时，百合浆液中的底物酶解完全；之后随着酶解时间的延长，百合浆液中的酶解效果反而降低。因此确定酶解时间为90 min。

2.1.4 3因素完全试验优化酶解工艺

根据单因素试验结果，选用L9(34)正交表进行正交设计，结果见表4、表5。

由表4、表5的实验数据可知，酶解温度对百合浆液酶解过程的影响最大，其次是果胶酶添加量，而酶解时间的影响最小；即各因素对百合酶解效果影响主次顺序为果胶酶的添加量＞酶解温度＞酶解时间。同时得到百合浆液酶解的最佳组合为A2B2C2，即果胶酶的添加量为240 U/mL，酶解温度为45℃，酶解时间为90 min（由于该处理组合不在正交试验组合中，所以需进行验证性实验）。A、B、C 3个因素的F值均大于F0.01，表明3个因素对百合浆液酶解效果的影响均达到极显著水平。

2.1.5 验证性实验

正交试验结果的最佳组合A2B2C2和正交试验结果表中的皂苷总量最高的试验组合A2B1C2，分别做3组平行试验，测定皂苷含量，以百合酶解浆液的皂苷总量为指标，取平均值。结果发现，组合A2B2C2和组合A2B1C2的百合酶解浆液的皂苷含量分别为1.674 mg/mL和1.645 mg/mL，试验组合为A2B2C2的百合酶解浆液的皂苷总量较高，而且从经济效益方面考虑，此试验组合的可行性较好。因此,百合酶解的最佳试验组合为A2B2C2，即果胶酶的添加量240 U/mL、酶解温度为45℃、酶解时间90 min。

表4 酶解工艺正交试验的直观分析表

表5 百合酶解工艺正交试验方差分析表

表6 不同酵母菌种对红曲百合蜂蜜酒品质的影响

2.2 红曲百合蜂蜜酒酿造工艺的优化

2.2.1 酵母菌种对红曲百合蜂蜜酒品质的影响

3种酵母的不同组合对红曲百合蜂蜜酒的影响结果见表6。

由表6可知，在3个菌种混合发酵条件下，酒的口味舒适、香气协调，在同水平试验中为最佳，因此较优的发酵菌种为3个菌种混合。

2.2.2 初始糖度对红曲百合蜂蜜酒品质的影响

在3%红曲添加量，3个菌种混合条件下，采用不同百合蜂蜜混合液初始糖度进行发酵，对发酵后的产品进行感官评分，结果见表7。

由表7可知，随着起始糖度的加大，残糖增多，得到的蜂蜜酒酒精度增高，初始糖度太高抑制酵母的生长代谢，并且残糖比较高，酒体浑浊。综上分析结果，确定最佳蜂蜜水起始糖度为26°Bx。

2.2.3 百合酶解液添加量对红曲百合蜂蜜酒品质的影响

以蜂蜜水起始糖度为26°Bx、3%红曲添加量、混合酵母菌接种量0.8%，采用不同百合酶解液添加量进行发酵，对发酵后的产品进行感官评分，结果见表8。

表7 初始糖浓度对百合蜂蜜酒的品质影响

表8 不同百合酶解液添加量对百合蜂蜜酒品质的影响

由表8可知，随着百合酶解液添加量的增大，残糖减少，得到的蜂蜜酒酒精度增高。采用25%～35%百合酶解液添加量时，虽然酒精度较高，残糖却较低，酒体感官品质下降。综上分析，确定发酵的最佳百合酶解液添加量为25%。

2.2.4 酵母接种量对红曲百合蜂蜜酒品质的影响

以蜂蜜水起始糖度为26°Bx、3%红曲添加量、百合酶解液添加量为25%，使用不同的酵母接种量对蜂蜜百合酶解液进行发酵，对产品进行感官评分，结果见表9。

表9 不同酵母接种量对百合蜂蜜酒品质的影响

由表9可知，随着酵母接种量的增大，残糖减少，得到的蜂蜜酒酒精度增高。采用0.74%接种量时，虽然酒精度较高，残糖也较低，但其酒体感官品质下降。综合以上分析结果，确定发酵的酵母最佳接种量为0.66%。

2.2.5 红曲添加量对红曲百合蜂蜜酒品质的影响

以蜂蜜水起始糖度为26°Bx、酵母接种量为0.66%、百合酶解液添加量为25%，采用不同的红曲添加量，对产品进行感官评分，结果见表10。

表10 不同红曲添加量对百合蜂蜜酒品质的影响

由表10可知，随着红曲添加量的加大，发酵速度过快，大于糖化速度，酒精度增高，但残糖增大。红曲添加量比较大，会抑制酵母菌的生长代谢，并且糖度较高，酒体偏浑浊。综上分析，确定最佳红曲添加量为4%。

2.2.6 正交试验优化红曲百合蜂蜜酒酿造工艺

根据单因素试验的结果，以蜂蜜水初始糖度、百合酶解液添加量、酵母接种量、红曲添加量作为考察因素，对红曲百合蜂蜜酒的酿造工艺进行优化实验。结果及分析见表11、表12。

由表11、表12可看出，通过正交分析，影响产品感官品质的各因素的主次顺序为C＞B＞A＞D，即酵母接种量＞百合酶解液添加量＞蜂蜜水初始糖度＞红曲添加量；同时得到较佳的酿造工艺组合为A3B3C3D2，即蜂蜜水初始糖度（A）为26 °Bx，蜂蜜百合酶解液添加量（B）为25%，酵母接种量（C）为0.66%，红曲添加量（D）为4%；置信度为95%，4个因素对感官评价的影响均达到极显著效果。

采用正交试验结果的最佳组合A3B3C3D2和正交试验结果表中的评分最高的试验组合A3B1C3D2进行验证实验。结果发现，组合A3B3C3D2和组合A3B1C3D2的感官评分分别为89分和 87分，且A3B3C3D2酒体丰满、清亮透明、光泽度好，口感醇厚细腻，各结果均表明组合A3B3C3D2的效果更佳。

最后以3 L投料按照组合A3B3C3D2进行3个批次的验证试验，对产品的酒精度、糖含量及最终pH值进行检测，并与标准产品要求进行比较。结果见表13。

表11 酿造工艺优化正交试验结果分析表

表12 酿造工艺对感官评价影响的方差分析表

表13 验证试验结果测定

表13结果表明，3批次的产品各项指标均符合要求。所以最终确定最佳工艺为A3B3C3D2即蜂蜜水初始糖度（A）为26°Bx，蜂蜜百合酶解液添加量（B）为25%，酵母接种量（C）为0.66%，红曲添加量(D)为4%。

3 结论

3.1 百合酶解正交试验结果表明，最优酶解工艺条件组合为A2B2C2，即果胶酶的添加量240 U/mL、酶解温度为45℃、酶解时间90 min。

3.2 通过正交试验确定红曲百合蜂蜜酒的最优酿造工艺条件为：A3B3C3D2，即蜂蜜水初始糖度（A）为26°Bx，蜂蜜百合酶解液添加量（B）为25%，酵母接种量（C）为0.66%，红曲添加量（D）为4%，在此条件下，生产的红曲百合蜂蜜酒酒体丰满、清亮透明、光泽度好，口感醇厚细腻，感官评分为89分。

3.3 对最佳酿造工艺组合进行验证实验，表明该工艺合理可行。所得的产品纯正柔和，各理化指标：酒精度为13.0%vol、糖度为12.0 g/L、pH3.2，均符合发酵饮料的标准，适合于批量化生产。结合当前的农业现状，红曲百合蜂蜜酒具有广阔的应用前景。

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