JNK抑制剂对福尔马林内脏炎症痛大鼠痛觉敏感化的影响*

张家君 岳 伟 张灿文 胡冬梅 袁 慧 杨明峰 牛敬忠 张颜波△

（1泰山医学院附属医院超声科，泰安271000；2泰山医学院附属医院消化科，泰安，271000；3泰山医学院附属医院神经内科，泰安 271000）

与躯体痛比较，内脏炎症痛缺少特异、有效的治疗药物，所以探索、研发新型、有效的内脏炎症痛镇痛药物迫在眉睫[1]。痛觉敏感化包括痛觉过敏和痛觉异常等，影响着内脏炎症痛的形成和维持，在痛觉调制中发挥重要作用，是内脏炎症痛关键发病机制[2,3]，众多神经递质、通道和受体等信号通路参与内脏炎症痛痛觉调制过程，导致内脏炎症痛“痛觉敏感化”。痛觉敏感化将是内脏炎症痛新型镇痛药物的研发方向[1,4]。MAPKs通路包括MAPKERK通路、MAPKJNK通路、MAPKP38通路和MKK5/MAPKERK5 共4条通路，研究发现脊神经节神经元内P38、ERK激活，参与内脏痛形成与维持的痛觉调制过程；与ERK、P38激活通路相比，JNK作为一种应激激活的蛋白激酶在病理性痛觉敏感化中研究相对较少，在内脏炎症痛觉敏感化中的作用研究更少[5～7]。故本实验拟用福尔马林直肠粘膜下复制内脏炎症痛模型[8]，经脊髓蛛网膜下腔插管给予JNK抑制剂SP600125，观察JNK抑制剂对内脏炎症痛疼痛评分和脊髓背角神经元电活动的影响，探索JNK抑制剂对内脏炎症痛痛觉敏感化的作用，以期进一步探讨内脏炎症痛治疗的分子靶点。

方 法

1.试剂与材料

SP600125（美国Santa Cruze公司），福尔马林、乙醚和戊巴比妥钠（北京西中化工厂），PE-10管（ID:0.28mm; OD:0.61mm, Becton Dickinson公司），有机玻璃行为学观察箱（首都医科大学神经生物研究室制），大鼠手持直肠窥器（专利号：CN200820173538.2），钨丝电极(3～5MΩ，William D.Willis教授捐赠)、多导电生理记录仪（MP150型）（美国Biopac公司）。

2. 实验动物及分组

选用清洁级雄性SD大鼠，重200～250 g，山东省中医药大学实验动物中心提供，实验动物许可证号：SCXK (鲁) 2005-0015。实验随机分为4组：福尔马林(formalin, F)直肠致炎组（F组）；福尔马林直肠致炎和脊髓蛛网膜下腔内插管（intrathecal, IT）组（IT组）；福尔马林直肠致炎、脊髓蛛网膜下腔内插管并注射生理盐水组（NaCl组）;福尔马林直肠致炎、脊髓蛛网膜下腔内插管并注射SP600125组（SP600125组）；每组大鼠12只，共48只。

3.脊髓蛛网膜下腔内插管及给药

根据我们实验室既往成熟方法[8,9]，用PE-10管插入大鼠脊髓蛛网膜下腔，插入长度7.5 cm，外端留有4.5 cm左右。本实验中NaCl和SP600125组，分别在福尔马林直肠致炎前30min经PE-10插管注射 20 μl 0.9%lNaCl、20 μl SP600125 溶液（含 10 μg SP600125），然后注入10 μl 0.9% NaCl冲洗插管，保证注射药品全部进入蛛网膜下腔。

4.内脏炎症痛模型复制

根据我们实验室既往成熟方法[8,9]，大鼠乙醚持续麻醉，经肛门插入自制的直肠窥器（专利号：CN200820173538.2），距肛门约35 mm处，用针长8 cm的1 ml注射器于直肠粘膜下注射100 μl 5%的福尔马林。

5.内脏痛行为学观察

福尔马林致痛后，大鼠共有4种疼痛行为：①舔腹(L)；②伸腰(B)；③侧扭(C)；④全身收缩(W)。疼痛评分公式计算：S = 1L + 2B + 3C +4W。L，B，C和W代表在一段时间内相应行为的次数。4组大鼠，每组8只，每15 min进行一次疼痛计分，连续记录大鼠的行为120 min[8,9]。

6.脊髓背角神经元放电记录

根据我们既往成熟方法进行脊髓背角神经元电生理记录[8,9]。SD大鼠以40 g/L的戊巴比妥钠(40 mg/kg)腹腔注射麻醉后，用钨丝电极(3～5 MΩ)，在L6～S1背角处进行胞外记录，通过对直结肠扩张性刺激敏感性不同鉴别出广动力范围神经元，神经信号通过多导电生理记录仪记录并分析。以15 min为单位分析神经元放电频率，福尔马林注射前神经元放电频率为基线，即100%，注射后的放电频率以其占基线的百分比表示。观察记录注射福尔马林后120 min内脊髓背角神经元放电频率的变化，4组大鼠，每组8只，每15 min作为一个时间段，共8个时间段。

7.统计学方法

4个实验组分别以15 min共8个时间段记录疼痛反应和神经元放电频率变化。神经元放电频率以给药前神经元的放电频率为参照, 计算给药后反应的相对值：给药后实际反应频率/给药前实际反应频率×100%。所有实验数据均以均数±标准差(±SD)表示，统计学检验采用SPSS 10.0统计软件中的重复测量双因素方差分析进行比较，P ＜ 0.05为差异有统计学意义。

图1 4种内脏痛行为反应[9]L:舔腹；B:伸腰；C:侧扭；W:全身收缩Fig.1 Four kinds of formalin-induced painful behaviors[9]L: abdominal licking and nibbling; B: body stretching; C: contraction of the flanks; W: whole body contraction.

图2 福尔马林注射后各组不同时间段的疼痛分数SD)*P ＜ 0.05, **P ＜ 0.01, 与 F 组相比较Fig. 2 The time course of pain scores after formalin injection(±SD)N: Formalin group; IT: Intrathecal group; NaCl:NaCl group; SP600125: SP600125 group. *P ＜ 0.05,**P ＜ 0.01, compared with group F.

结 果

1.福尔马林复制内脏炎症痛模型的疼痛反应

四个实验组大鼠在注射福尔马林后30 min均达到疼痛评分的的最大值，并且在注射福尔马林后45 min至120 min之间，疼痛评分逐渐降低。前60 min内行为表现主要以W、C、B反应为主；而在后60 min内主要以L反应为主（见图1）。

2. JNK抑制剂SP600125减轻内脏炎症痛反应

F、IT、NaCl组和SP600125组大鼠在注射福尔马林后30 min均达到疼痛评分的最大值，从注射福尔马林后45 min至120 min内，疼痛评分逐渐降低，120 min时疼痛评分将至致痛前水平。SP600125组在前90 min内疼痛分数显著低于F组（P ＜ 0.05或P ＜ 0.01），IT组和NaCl组与F组相比较均未见显著性差异（见图2）。

3. 福尔马林直肠黏膜下注射后神经元放电频率的变化

注射福尔马林后，F组神经元放电频率立即明显增加，致炎后0～15 min、15～30 min和30～45 min内的放电频率分别为致炎前基线水平的 252.36 ± 28.76%、288.74 ± 40.64% 和 186.47 ±32.16%，在30 min时达放电频率最大值，与致炎前相比均有显著性增加（P ＜ 0.05或P ＜ 0.01）, 提示福尔马林注射后出现疼痛敏感化。在注射福尔马林后45 min至120 min之间，放电频率逐渐降低，各时间段与致炎前相比虽有增加，但无显著性意义（见图3）。

4. JNK抑制剂SP600125降低大鼠背角神经元放电频率

经蛛网膜下腔插管给予JNK抑制剂SP600125 30 min后，福尔马林直肠黏膜下注射致炎后神经元放电仍有增加，SP600125组在致炎后0～15 min、15～30 min和30～45 min两时间段的脊髓背角神经元放电频率分别为基线水平的146.86% ± 25.79%、175.49% ± 28.74%和126.48% ± 21.68%，与F组致炎后0～15 min、15～30 min和30～45 min内的放电频率 (252.36±28.76%、288.74±40.64%和186.47±32.16%) 分别相比均有显著性的降低（P ＜ 0.05或P ＜ 0.01）； IT组和NaCl组与F组相比没有显著性差异（见图4）。

图3 福尔马林直肠黏膜下注射后神经元放电频率的变化*P ＜ 0.05, **P ＜ 0.01, 与注射前相比较Fig.3 Changes of the firing rate after formalin injection*P ＜ 0.05, **P ＜ 0.01, compared with Before injection.

讨 论

内脏痛以性质模糊、定位不明确、多通路传导、痛觉过敏、痛觉异常和牵涉痛为特点，严重影响病人生活、工作、学习和认知功能等[10,11]。内脏痛发病机制尚不明确，远远落后于躯体痛研究，严重影响了内脏痛病人的治疗与预后[12,13]。痛觉敏感化将是内脏炎症痛新型镇痛药物的研发方向，针对多个信号通路联合药物镇痛治疗优于单一药物，联合治疗是内脏痛治疗原则[1,4]。我们既往研究表明，众多信号分子，如PKC、ERK1/2参与内脏炎症痛发病机制，在内脏炎症痛觉敏感化形成和维持中起重要作用，均可以作为内脏炎症痛治疗新的药物靶点[7～9]。JNK作为MAPKs信号通路中的一员，在痛觉信号传递中发挥重要作用，缺少在内脏炎症痛中作用的细致研究，目前众多研究表明，PKC信号通路可以通过下游JNK信号通路，在神经元可塑、细胞凋亡等病理生理过程中发挥作用[14～16]。所以本研究观察JNK抑制剂对内脏炎症痛觉敏感化的影响，研究JNK抑制剂对内脏炎症痛的治疗作用，对探索联合信号靶点（如PKC、JNK等）治疗内脏炎症痛具有探索意义，也符合联合治疗内脏痛的药物治疗原则。

MAPKs通路包括MAPKERK通路、MAPKJNK通路、MAPKP38通路和MKK5/MAPKERK5 4条通路[7]，Kondo T等、Sakurai J等分别利用胃扩张内脏痛模型，研究发现DRG神经元内P38、ERK激活，参与内脏痛形成与维持的痛觉调制过程[17,18]；与ERK、P38激活通路相比，JNK在病理性痛觉敏感化中研究相对较少，在内脏痛痛觉敏感化调制中的作用研究更少[7]。Hao等利用躯体痛模型观察到，大鼠脚掌注射蜂毒素后产生痛觉感受和痛觉过敏，在注射前、后脚掌炎症局部给予 JNK抑制剂SP600125均可明显抑制蜂毒素引起的外周自发痛觉感受和热痛敏，但对机械痛敏效果较差，得出JNK可能对致炎后疼痛的维持和热痛敏的产生起重要作用，且外周的热痛敏和机械痛敏具有不同机制。同样Obata等在 L5脊神经结扎 (SNL)神经病理性痛模型中，鞘内注射 JNK 抑制剂 SP600125后，减轻 SNL引起的机械痛敏。我们应用内脏炎症痛模型研究发现，福尔马林直肠粘膜下致炎后，30 min时疼痛评分达最大值，同时脊髓背角神经元放电达高峰，说明30 min达到痛觉敏感化的高峰，给予JNK抑制剂SP600125后，能明显减少疼痛评分，抑制脊髓背角神经元放电，说明JNK抑制剂SP600125减轻内脏炎症痛反应，抑制内脏炎症痛觉敏感化，对内脏炎症痛具有镇痛作用。JNK作为一种应激激活的蛋白激酶，JNK被痛觉信号激活后，可通过一系列下游转录因子途径发挥作用：如Jun家族(c- Jun、JunB、JunD)、E lk-1、p53、ATF- 2、JDP2、c- M yc、STAT、NFAT 和 Pax家族等，在炎症反应和神经病理性损伤致痛觉敏感化中起重要作用[7]。JNK分为JNK1、JNK2和JNK3三种亚型，所以完善JNK（JNK1、JNK2和JNK3）那种亚型参与内脏炎症痛痛觉敏感化调制，同时探索PKC-JNK作为一条信号通路在内脏炎症发病机制中的作用，以及联合抑制PKC、JNK治疗内脏炎症痛，将是我们下一步研究的方向。

综上所述，JNK抑制剂SP600125通过降低内脏炎症痛疼痛评分和抑制脊髓背角神经元放电，起到抑制内脏炎症痛痛觉敏感化作用，JNK可能为内脏炎症痛镇痛靶点之一。

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