针刺留针与否对血管性痴呆大鼠认知功能及皮层神经元损伤的影响

李天然 叶阳 杨静雯 肖凌勇 王雪蕊 闫超群 邵佳凯 刘存志

摘要：目的 觀察留针与不留针情况下针刺“百会”配伍“足三里”对血管性痴呆（VD）大鼠认知功能及大脑皮层神经元损伤的影响，探讨留针与否的针刺效应。方法 采用永久性双侧颈总动脉结扎方法建立VD大鼠模型。实验大鼠随机分为假手术组、模型组、留针组、不留针组，每组8只。针刺模型大鼠“百会”+“足三里”后，Morris水迷宫实验检测大鼠空间学习记忆能力，尼氏染色检测大鼠大脑皮层神经元损伤。结果 与假手术组比较，模型组大鼠空间学习记忆能力明显降低，皮层神经元损伤明显；与模型组比较，留针组、不留针组空间学习记忆能力均显著提高，皮层神经元损伤改善；其中，留针组空间学习记忆能力提高更多，皮层神经元损伤改善更明显。结论 针刺可改善VD大鼠空间学习记忆能力和皮层神经元损伤，留针效果更好。

关键词：血管性痴呆；针刺效应；留针；认知功能；皮层神经元；大鼠

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2018.05.014

中图分类号：R245 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2018）05-0061-05

Effects of Acupuncture Needle Retaining or Not on Cognitive Function and

Cortical Neurons in Rats with Vascular Dementia

LI Tian-ran1，2， YE Yang2， YANG Jing-wen2， XIAO Ling-yong2，

WANG Xue-rui2，3， YAN Chao-qun2， SHAO Jia-kai2， LIU Cun-zhi4

1. Tianjin University of Traditional Chinese Medicine， Tianjin 300193， China； 2. Acupuncture Center Affiliated to Beijing Hospital of TCM Affiliated to Capital Medical University， Beijing 100010， China； 3. Beijing Institute of Traditional Chinese Medicine， Beijing 100010， China； 4. Dongfang Hospital， Beijing University of

Chinese Medicine， Beijing 100078， China

Abstract： Objective To compare the effects of acupuncture needle retaining or not in “Baihui” compatibility “Zusanli” on cognitive function and cortical neurons in rats with vascular dementia （VD）； To discuss the acupuncture effects of acupuncture needle retaining or not. Methods VD model was established by permanent bilateral common carotid arteries occlusion. The experimental rats were randomly divided into sham-operation group， model group， needle retaining group， without needle retaining group， with 8 rats in each group. The acupoints “Baihui” and “Zusanli” were used. Morris water maze test was employed to detect the abilities of spatial learning and memory in rats. Nissls staining and immunofluorescence technique were used to observe the status of cortical neurons. Results Compared with sham-operation group， the abilities of spatial learning and memory decreased significantly and the injuries of cortical neurons were severe. Compared with model group， the abilities of spatial learning and memory in needle retaining group and without needle retaining group increased significantly and the injuries of cortical neurons were improved， among which， the abilities of spatial learning and memory was increased more， and the injuries of cortical neurons were better improved in the needle retaining group. Conclusion Acupuncture can improve the abilities of spatial learning and memory and cognitive function， and acupuncture needle retaining has better effects.

Keywords： vascular dementia； acupuncture effects； needle retaining； cognitive function； cortical neurons； rats

基金项目：北京市教育委员会科技计划重点项目（KZ201710025025）

通讯作者：刘存志，E-mail：lcz623780@126.com

血管性痴呆（vascular dementia，VD）是指以缺血缺氧性或出血性脑损伤造成的记忆、认知及行为等脑区低灌注的脑血管疾病所致的严重认知功能障碍综合征。我国65岁以上老年人VD患病率为1.2%～4.2%，70岁以上老年人年发病率为每千人6～12例[1]。与学习记忆有关的脑内结构主要是大脑皮质联合区、海马及其邻近结构。其中，大脑皮层特别是额叶、颞叶是远事记忆信息转变、贮存的主要部位[2]。在慢性脑血流灌注不足时，模型大鼠大脑皮质中出现大量神经元凋亡[3-4]。

本课题组前期研究表明，针刺可改善VD模型大鼠的空间学习记忆能力，该作用可能是通过减轻氧化应激[5-6]、神经元凋亡[7]、神经炎症等机制实现的。在针刺治疗疾病的过程中，留针与否尚存在一定争议[8-9]。本课题组前期研究发现，针刺“百会”“足三里”能有效改善慢性脑低灌注引起的大鼠学习和记忆功能损害。本研究拟通过行为学和病理学方法，观察留针与否对VD大鼠认知功能和皮层神经元损伤的影响，以期为临床上针刺治疗VD是否留针提供一定的参考。

1 材料与方法

1.1 动物及分组

SPF级SD雄性大鼠32只，4月龄，体质量270～300 g，北京維通利华实验动物技术有限公司，动物许可证号SCXK（京）2012-0001。饲养于中国中医科学院中医基础理论研究所清洁级动物房。所有动物实验均满足动物伦理委员会的要求。根据随机数字表将动物分为假手术组、模型组、留针组、不留针组，每组8只。

1.2 主要试剂和仪器

戊巴比妥钠（P3761，Sigma），多聚甲醛（广州晶欣生物科技有限公司），乙醇（北京化工厂），碘伏（青岛海诺生物工程有限公司），中性树脂（国药集团化学试剂股份有限公司），Morris水迷宫系统（美国CSI公司），冰冻切片机（德国Leica公司），焦油紫染色液（上海碧云天生物技术公司），DHG-9023A烤箱（上海林频仪器有限公司），光学显微镜（日本Olympus），华佗牌0.25 mm×13 mm一次性针灸针，苏州医疗用品厂有限公司。

1.3 造模

大鼠腹腔注射2.5%戊巴比妥钠（0.2 mL/100 g）麻醉。颈正中切开皮肤，剥离胸骨舌骨肌、肩胛舌骨肌与胸骨乳突肌，分离双侧颈总动脉，采用5-0丝线将双侧颈总动脉永久性结扎。切口处滴少许庆大霉素，防止感染。假手术组除不结扎双侧颈总动脉外其他操作同手术组。大鼠术后死亡率为30%。

1.4 Morris水迷宫实验

水迷宫水池直径160 cm，高40 cm，水深30 cm。池壁上4个等距离点将水池分为4个象限，将平台置于东北象限。末次针刺后第2日开始水迷宫试验。水迷宫实验包括定位航行实验和空间探索实验。定位航行实验反映大鼠的学习能力。将大鼠背对水池随机从4个不同象限放入水中，记录朝向角（动物开始游泳的方向与“入水点-平台”连线所成的夹角）和逃避潜伏期。如果90 s内找不到平台（潜伏期记为90 s），则由操作者帮助其上平台，停留30 s，连续训练5 d。空间探索实验反映大鼠的记忆能力。在实验第6日撤除平台，选任意相同入水点将大鼠放入水中，记录90 s内大鼠在池中的游泳轨迹和时间及和90 s内跨越原平台象限次数。

1.5 尼氏染色

末次针刺后第2日大鼠灌注，并将脑组织置于4%多聚甲醛液中4 ℃恒温过夜进行后固定。35%蔗糖溶液浸泡脱水1周，OCT冰冻包埋剂包埋，冠状位连续10 μm厚度冰冻切片。将脑片贴于预先明胶处理过的载玻片上，在焦油紫工作液中孵育45 min，用蒸馏水洗去浮色后入特殊分色液，100%乙醇脱水，二甲苯常规脱水后中性树胶封片，光学显微镜下观察，尼氏体为嗜碱性斑块或细颗粒。在每张载玻片的大脑皮层额叶区分别随机选取5个视野，观察皮层尼氏染色结果并拍照分析。

1.6 免疫荧光

将切片准备好后加入NeuN（Abcam）一抗进行孵育（1∶400，4 ℃冰箱过夜），再加入羊抗兔IgG二抗孵育（1∶400，红色，37 ℃避光60 min），洗涤样品，封片。BX53型荧光显微镜下拍照，观察大鼠皮层神经元的损伤情况。

1.7 干预

留针组和不留针组取穴均参照动物穴位图谱[10]取“百会”“足三里”，行捻转补法（捻转角度<180°，频率>60次/min）。留针组行针30 s，留针20 min，不留针组行针30 s，不留针。2组均每日1次，治疗6 d后休息1 d，连续2周，共治疗12次。假手术组和模型组由同一实验员进行与针刺组相同时间、相同程度的捉抓刺激。

1.8 统计学方法

采用SPSS17.0统计软件进行分析。实验数据以—x±s表示。采用重复测量方差分析比较各组逃避潜伏期；其他数据比较采用方差分析。P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 水迷宫实验结果

与假手术组比较，模型组大鼠朝向角明显增大，差异有统计学意义（P<0.05）；与模型组比较，各针刺组朝向角均明显减小，差异有统计学意义（P<0.05），留针组朝向角较不留针组更小，差异有统计学意义（P<0.05），见图1。与假手术组比较，模型组大鼠逃避潜伏期明显延长，差异有统计学意义（P<0.05）；与模型组比较，针刺组逃避潜伏期明显缩短，差异有统计学意义（P<0.05），留针组逃避潜伏期较不留针组明显缩短，差异有统计学意义（P<0.05），见图2。与假手术组比较，模型组大鼠穿越平台次数明显减少，差异有统计学意义（P<0.05）；与模型组比较，各针刺组穿越平台次数均明显增加，差异有统计学意义（P<0.05），留针组穿越平台次数较不留针组明显增加，差异有统计学意义（P<0.05），见图3。

注：与假手术组比较，*P<0.05；与模型组比较，△P<0.05；

与不留针组比较，▲P<0.05

图1 各组大鼠水迷宫实验朝向角比较（—x±s）

注：与假手术组比较，*P<0.05；与模型组比较，△P<0.05；

与不留针组比较，▲P<0.05

图2 各组大鼠水迷宫实验逃避潜伏期比较（—x±s）

注：与假手术组比较，*P<0.05；与模型组比较，△P<0.05；

与不留针组比较，▲P<0.05

图3 各组大鼠水迷宮实验穿越平台次数比较（—x±s）

2.2 尼氏染色结果

假手术组大鼠皮层神经元排列整齐、紧凑，无明显尼氏体破裂的现象；模型组大鼠皮层神经元排列散乱，细胞带出现断裂，神经元出现尼氏体碎裂、细胞调亡；各针刺组大鼠皮层神经元排列尚整齐，但细胞间隙增宽，细胞带较薄，少量神经元可见尼氏体碎裂、胞质中央尼氏小体消失，留针组大鼠皮层神经元较不留针组排列更为整齐、紧凑，少见明显尼氏体破裂的现象。见图4。

2.3 免疫荧光结果

假手术组大鼠皮层神经元数量较多，排列规则；模型组神经元数量明显减少，细胞排列散乱；各针刺组神经元形态改善，数量显著增多，留针组较不留针组皮层神经元数量更多，排列更为规则。见图4。

图4 各组大鼠皮层神经元损伤情况（×400）

3 讨论

Morris水迷宫实验在神经科学研究中广泛用于评价空间学习和记忆能力[11-12]。逃避潜伏期是该实验应用最多的指标之一，但其缺点是易受动物游泳能力的影响。朝向角越小说明空间学习记忆能力越好。与逃避潜伏期相比，朝向角不仅能更好地消除速度的影响，而且更具有敏感性[13-14]，因此，本研究选用该指标作为水迷宫的主要结局指标之一。大脑皮层在学习和记忆等高级神经活动中起着重要作用，慢性低灌注脑血流下降导致该区域神经元慢性进行性变性、脱失。慢性低灌注后，部分皮质纤维明显疏松，少突胶质细胞及其髓鞘结构出现不同程度的损伤，是慢性低灌注后实验大鼠认知行为和神经电生理功能减退的形态学基础[15]。尼氏体是神经元受损的细胞标志性特征结构之一，慢性脑血流灌注不足时大鼠皮质区神经元发生退行性变，尼氏体的结构也被破坏[16]。随着脑血流的恢复，皮质区尼氏体逐渐得到修复，神经元的数量和功能有所恢复，表明在慢性脑缺血早期皮质区神经元损伤可逆[17]。本课题组前期研究结果显示，针刺可显著缓解VD大鼠海马和大脑皮层的神经元凋亡情况，进而改善VD大鼠的空间学习记忆能力[18-19]。

针刺治疗中有效刺激量是影响针刺临床疗效的重要因素。针刺的有效刺激量受多种因素影响，如针刺捻转角度和频率、针刺间隔时间、是否留针等，其中是否留针是影响针刺刺激量的关键因素之一。留针，是指将针刺入腧穴，行针得气并施以补泻手法后，将针留置腧穴内一段时间。留针目的是加强针刺的作用和便于继续行针施术，留针时间一般为20～30 min。临床上针刺治疗疾病多以留针为主，但也有研究认为不留针的效果不劣于留针，甚至推荐某些疾病应该不留针。高峰等[20]观察针刺浅刺留针与否治疗急性期周围性面瘫的疗效差异，发现周围性面瘫急性期浅刺是否留针，对此病预后无明显影响。冷军[21]研究也认为针刺留针与不留针均可促进新生大鼠脑缺血缺氧后神经干细胞的增殖和分化，促进神经细胞修复，减轻功能缺损程度。董梅[9]观察留针与不留针分别对颈性眩晕患者椎基底动脉系统血流动力学即时效应的影响，结果显示针刺留针与不留针均可明显改善椎基底动脉血流速度，且二者无显著差异，提示临床可以不留针代替留针。留针是针刺的重要环节，但对于是否需要留针，还需要辨证对待，不可机械应用。目前，对于针刺治疗VD是否应该留针，以及针刺留针与否的效果差异尚缺乏相关研究。

本实验结果表明，针刺组均可改善VD大鼠空间学习记忆能力，但留针的效果优于不留针。而且，尼氏染色和免疫荧光的实验结果同样显示，留针组对皮层神经元凋亡的改善作用明显优于不留针组。与本研究结果相似，有研究认为针刺留针的效果优于不留针。罗丽平等[22]探讨针刺留针与不留针对健康人心脏自主神经的生理调节作用的影响，结果发现，针刺留针和不留针均可减慢心率，但留针减慢心率的作用时间长于不留针。

一般而言，是否留针及留针时间长短主要据疾病的病情、性质而定。《灵枢·邪气藏府病形》曰：“刺急者，深内而久留之；刺缓者，浅内而疾发针……”，《灵枢·经脉》有“热则疾之，寒则留之”；其次，应按时节选择是否留针。《子午流注针经》云：“应冬春者，宜留针待气至；应秋夏者，呼吸数毕便宜去针。”现代研究认为，针刺的临床效应取决于有效的刺激量和机体的反应，而有效的刺激量由刺激强度和持续时间构成。针刺留针可能会通过延长持续时间积累刺激量，从而增强临床疗效，效果因而优于不留针[23]。

综上，针刺治疗是否留针应根据疾病情况、患者体质、经脉腧穴及病程长短等因素而定。在一定的刺激强度下，是否留针直接影响针刺疗效。本课题研究发现，针刺留针与不留针均可改善VD大鼠的学习记忆能力和皮层神经元凋亡，且留针效果优于不留针，可为临床留针与否提供借鉴。

参考文献：

[1] 高风超，陈翔，田新英.血管性痴呆危险因素及发病机制的研究进展[J].医学综述，2014，20（6）：1068-1071.

[2] 彭博.慢性铅暴露对小鼠学习记忆功能及大脑皮层神经元PI3K/PKB信号分子的影响[D].沈阳：中国医科大学，2009.

[3] 王成牛，冯展波，彭彬，等.藁本内酯对低灌注大鼠大脑皮质的神经保护作用[J].第二军医大学学报，2016，37（2）：251-255.

[4] 王维.慢性缺血致血管性痴呆大鼠行为学、病理及细胞骨架蛋白的研究[D].长春：吉林大学，2005.