益气解毒方对鼻咽癌细胞标志物T淋巴瘤侵袭转移诱导因子1及Ras相关C3肉毒素底物1表达的影响

陈艳 杨婷

摘要：目的 观察益气解毒方对鼻咽癌细胞标志物T淋巴瘤侵袭转移诱导因子1（Tiam1）和Ras相关C3肉毒素底物1（Rac1）表达的影响，探讨其作用机制。方法 实验分为对照组、益气解毒方组和阳性药组，分别予生理盐水、益气解毒方药液和5-氟尿嘧啶注射液，干预后置于37 ℃、5%CO2孵育箱中培养，24 h后采集细胞。免疫组化和Western blot检测细胞Tiam1和Rac1蛋白表达，RT-PCR检测细胞Tiam1和Rac1 mRNA表达。结果 与对照组比较，益气解毒方组和阳性药组Tiam1和Rac1的蛋白和mRNA表达明显降低，且益气解毒方组降低更明显（P<0.01）。结论 益气解毒方可能通过抑制肿瘤细胞标志物Tiam1和Rac1的表达，达到治疗鼻咽癌的作用。

关键词：益气解毒方；鼻咽癌；T淋巴瘤侵袭转移诱导因子1；Ras相关C3肉毒素底物1

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2018.05.011

中图分类号：R285.5 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2018）05-0046-04

Effects of Yiqi Jiedu Prescription on Expressions of Nasopharyngeal Carcinoma

Cell Markers Tiam1 and Rac1

CHEN Yan， YANG Ting

College of Traditional Chinese Medicine， Changsha Medical University， Changsha 410219， China

Abstract： Objective To investigate the effects of Yiqi Jiedu Prescription on expressions of nasopharyngeal carcinoma cell markers Tiam1 and Rac1； To explore its possible mechanisms. Methods The experiment included blank group， Yiqi Jiedu Prescription group and positive control group， and the three groups were given saline， Yiqi Jiedu Prescription and 5-Fu injection， respectively. After being intervened， the three group were cultured at 37 ℃ in 5% incubator. After 24 hours， the cells were collected. The protein levels of Tiam1 and Rac1 were evaluated by Western blot and immunohistochemistry. The mRNA levels of Tiam1 and Rac1 were determined by real-time PCR. Results Compared with blank group， protein and mRNA expressions of Tiam1 and Rac1 decreased in Yiqi Jiedu Prescription group and positive control group， and Yiqi Jiedu Prescription group showed more significant decrease （P<0.01）. Conclusion Yiqi Jiedu Prescription plays a role in the treatment of nasopharyngeal carcinoma by inhibiting the expression of tumor cell markers Tiam1 and Rac1.

Keywords： Yiqi Jiedu Prescription； nasopharyngeal carcinoma； Tiam1； Rac1

鼻咽癌是頭颈部高发的恶性肿瘤之一，主要起源于鼻咽上皮细胞，在我国南方及东南亚地区较为常见。近年研究显示，T淋巴瘤侵袭转移诱导因子1（Tiam1）是重要的细胞调节因子，在多种肿瘤细胞中均有表达，与肿瘤的浸润、转移关系密切[1]。益气解毒方是临床治疗鼻咽癌的常用方，具有生津润燥、益气解毒的功效。前期临床观察显示，益气解毒方治

基金项目：湖南省教育厅科学研究项目（15C0162）

通讯作者：杨婷，E-mail：285934286@qq.com

疗鼻咽癌疗效确切[2-4]。本实验观察益气解毒方对鼻咽癌细胞标志物Tiam1和Ras相关C3肉毒素底物1（Rac1）表达的影响，探讨其作用机制。

1 材料与方法

1.1 细胞

人鼻咽癌5-8F细胞株，中南大学湘雅医学院细胞培养中心。

1.2 药物及制备

益气解毒方（黄芪20 g、天花粉10 g、白花蛇舌草10 g、射干10 g、党参5 g、黄连5 g、甘草3 g等），长沙医学院附属第一医院制备，处方饮片用三蒸水浸泡过夜，煮沸25 min过滤，离心后浓缩，加定量生理盐水配成1 g/mL溶液，抽滤除菌，4 ℃冰箱冷藏备用。5-氟尿嘧啶（5-Fu）注射液，南通精华制药有限公司，批号080607。

1.3 主要试剂与仪器

小牛血清，杭州四季青生物制品有限公司；胰蛋白酶，美国Difco公司；cDNA反转录试剂盒，美国MBI公司；HRP（sp-9001-3ml）标记二抗，北京康为生物试剂公司；兔抗人Tiam1（H-300）蛋白单克隆抗体，美国Santa Cruz公司；鼠抗人Rac1（610650）蛋白单克隆抗体，即用型非生物素免疫组化EliVision plus檢测试剂盒，福州迈新公司；PBS、Trizol试剂、PCR反应试剂盒，上海生工生物工程有限公司。多通道PCR仪（美国MJ PTC-220），双光束紫外分光光度计（美国LAMBDA BIO 20），凝胶电泳图像分析系统（BIO-RAD GD Doc2000，美国），DNA测序仪（美国ABI3100型）。

1.4 细胞培养

将人鼻咽癌5-8F细胞株置于含10%热灭活小牛血清的PRMI1640培养液中37 ℃培养，每毫升含青霉素100 U、链霉素100 ?g，37 ℃、5%CO2培养。PBS冲洗2次，当细胞长满至单层后，加入0.25%胰蛋白酶1 mL消化贴壁细胞。血清培养终止消化，细胞收集置离心管离心，细胞传代2～3次，取对数生长期细胞用于实验，调整细胞数为5×105/mL备用。将悬液接种于3孔板中，分成对照组、益气解毒方组和阳性药组进行处理。对照组加生理盐水培养，益气解毒方组加益气解毒方药液培养，阳性药组加5-Fu培养，37 ℃、5%CO2孵箱中培养48 h后收集细胞。

1.5 免疫组化检测T淋巴瘤侵袭转移诱导因子1蛋白表达

采用EliVision plus法染色，将制作好的切片脱蜡水化，加入复合消化酶进行酶修复，PBS冲洗3次×3 min，分别加入3%过氧化物酶、山羊血清工作液，37 ℃孵育30 min，滴加Tiam1一抗（稀释度1∶100），4 ℃过夜，温箱孵育30 min，PBS冲洗3次×3 min，分别加入生物素标记兔抗人及辣根酶标记链酶工作液后，再次PBS冲洗3次×3 min，滴加DAB显色试剂，镜下观察3～5 min，胞质出现棕黄色、黄棕色显示为阳性，苏木精复染2 min，脱水后放入碳酸锂10 s，梯度乙醇脱水干燥，中性树胶封固，镜下观察，拍照记录，对照组用PBS代替一抗阳性判定，以着色强度及阳性细胞数综合判断。着色强度：无色记0分，黄色记1分，棕黄色记2分；阳性细胞数≤10%记1分，11%～50%记2分，51%～75%记3分，>75%记4分。两项得分相乘结果<3分为阴性，3～4分为阳性，>4分为强阳性。最终结果由2位高年资药师采用双盲法获得，强阳性定义为高表达。

1.6 Western blot检测T淋巴瘤侵袭转移诱导因子1和Ras相关C3肉毒素底物1的蛋白表达

取出收集的细胞，加入含蛋白酶抑制的蛋白提取液中提取细胞总蛋白，BCA定量法测定蛋白浓度，收集上清液，定量提取10 mg标准蛋白，加入SDS上样缓冲液，PAGE凝胶电泳后转至PVDF膜封闭，加入Tiam1和Ras1一抗（1∶100），4 ℃摇床过夜，孵育30 min后加HRP标记羊抗兔（1∶100），孵育4 h后漂洗显影，用GAPDH做内参（OD值为目的蛋白灰度值/GAPDH灰度值），以上步骤重复3次。

1.7 RT-PCR检测T淋巴瘤侵袭转移诱导因子1和Ras相关C3肉毒素底物的mRNA表达

细胞培养达到对数生长期，将细胞收集于1.5 mL EP管中，按照试剂盒和反转录试剂盒说明书进行RNA提取和c-DNA的制备，采用软件设计引物，以GAPDH作为参照，Tiam1和Rac1引物序列见表1，反应条件：94 ℃ 5 min（94 ℃、30 s 57 ℃、30 s 72 ℃、30 s）×30 cycles；72 ℃ 10 min。引物均由上海生工生物工程有限公司合成，经吸光度扫描仪扫描后，用PCR条带软件进行定量分析，灰度值用ImageJ软件分析，结果以基因相对表达量表示。

1.8 统计学方法

采用SPSS19.0统计软件进行分析。实验数据以—x±s表示，经过方差齐性检验和正态检验后，采用方差分析，组间比较用LSD法。P<0.01表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 免疫组化检测结果

Tiam1在对照组中呈棕黄色、强阳性表达，在阳性药组阳性细胞表达均下降，益气解毒方组下降更明显（P<0.01）。见表2、图1。

图1 各组人鼻咽癌细胞Tiam1阳性表达（免疫组化染色，×200）

2.2 Western blot检测结果

与对照组比较，阳性药组和益气解毒方组Tiam1和Rac1蛋白表达显著降低，差异有统计学意义（P<0.01），且益气解毒方组Tiam1和Rac1蛋白表达降低更明显（P<0.01）。见表3、图2。

注：A.对照组；B.益气解毒方组；C.阳性药组

图2 各组人鼻咽癌细胞Tiam1和Rac1蛋白表达免疫印迹图

2.3 RT-PCR检测结果

与对照组比较，阳性药组和益气解毒方组Tiam1、Rac1 mRNA表达显著降低，差异有统计学意义（P<0.01），且益气解毒方组Tiam1、Rac1 mRNA表达降低更明显（P<0.01）。见表4、图3和图4。

注：A.对照组；B.益气解毒方组；C.阳性药组

图3 各组人鼻咽癌细胞Tiam1 mRNA表达凝胶电泳图

注：A.对照组；B.益气解毒方组；C.阳性药组

图4 各组人鼻咽癌细胞Rac1 mRNA表达凝胶电泳图

3 讨论

Tiam1是一个与肿瘤转移相关的重要基因，最初是从小鼠T淋巴瘤细胞中分离而来，它在T淋巴瘤的转移侵袭和传导中发挥重要作用，可激活Rho蛋白家族的活性并参与Rac1介导的信号通路，Rac1是Rho小G蛋白家族成员，属于Ras相关C3肉毒梭菌毒素底物蛋白，在外界细胞刺激下，Tiam1能影响Rac1从无活性的GDP结合状态向有活性的GTP结合状态转变，间接影响细胞粘附和运动，使其发挥相应的生物学效应，是Rac1的直接上游靶蛋白[5]。有研究表明，Rac1在胃癌等肿瘤细胞的侵袭和转移中发挥重要作用[6]，是肿瘤细胞的重要标志物之一。过表达Tiam1可诱导肿瘤细胞发生转移侵袭，其分子机制可能为其他肿瘤相关因子对Tiam1的调控作用及Tiam1对肿瘤细胞增殖与凋亡的影响。Shi Y L等[7]研究发现，过表达Tiam1对胃癌细胞生长、转移及侵袭有重要的促进作用；Li J等[8]研究表明，miR-22等基因能通过负向调控Tiam1的表达，抑制卵巢癌细胞的转移；Minard M E等[9]研究显示，通过检测在直肠癌细胞中，Tiam1可增加来源于上皮的肿瘤细胞的入侵，同时Tiam1在乳腺癌[10]、肾细胞癌[11]等组织中也呈高表达。Tiam1已成为恶性肿瘤预后的标志物[12]。

中医学无鼻咽癌的病名，在古籍中关于“失荣”“鼻渊”“恶核”“瘰疬”“上石疽”等病证的记载包含了现代鼻咽癌的病症特点和治疗方法。如《外科正宗》记载“日久渐大，坚硬如石，推之不移，按之不动，半载一年，方生阴痛，气血渐衰，形容瘦削，破烂紫斑，渗流血水”，《疮疡全书》提到上石疽“溃即放血，三日内毙”等，其病因及临床表现均与现代鼻咽癌相似。鼻咽癌在中医中的病机主要为正气亏虚、脏腑功能失调，外加毒邪入体、气血凝结，进一步演变为热毒壅盛、脏腑亏虚，最终导致正气衰竭而亡。中医治疗肿瘤主要侧重扶正祛邪，治以补气养血、滋阴温阳、清热解毒、软坚散结为主。益气解毒方是治疗鼻咽癌的基础方，本方以黄芪、党参等补气药为重，辅以白花蛇舌草和黄连以清热、解毒、化瘀、祛邪，以茯苓、天花粉养阴健脾。本方起到气阴双补、扶正祛邪及补泻并施的治疗作用，对鼻咽癌疗效显著。鲍锡金[13]对晚期大肠癌患者通过健脾益气解毒方联合化疗与单纯化疗对比研究发现，联合治疗效果明显；谢晶日等[14]研究显示，益气养阴化瘀解毒方对慢性萎缩性胃炎癌前病变气阴两虚夹毒患者有明显的治疗效果；许军等[15]研究显示，益气养阴解毒方联合肝动脉化疗栓塞术治疗原发性肝癌在保护患者肝功能、改善生活质量及延长其生存时间方面优于单纯肝动脉化疗栓塞术。以上研究均证实了益气解毒方在肿瘤方面的治疗效果。

本研究观察益气解毒方对鼻咽癌细胞标志物Tiam1的影响，通过实验数据分析得出，益气解毒方能显著降低Tiam1和Rac1的蛋白和mRNA表达，且效果优于5-Fu注射液。

综上，益气解毒方可抑制鼻咽癌细胞的增殖和侵袭，通过降低Tiam1和Rac1在鼻咽癌组织中的表达而发挥抗癌作用，为其临床治疗鼻咽癌提供依据。

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（收稿日期：2017-07-24）

（修回日期：2017-09-06；编辑：华强）