迁徙生长现象在变形杆菌检测中的应用

陈冠武 蔡 颖* 王凤军 周广彪 许如苏 苏建晖 张峥嵘 陈冬娥

（1.汕头出入境检验检疫局 广东汕头 515000；2.浙江经贸职业技术学院）

1 前言

变形杆菌属（Proteus）细菌包括5个种：普通变形杆菌（P．vulgaris）、奇异变形菌（P．mirabilis）、潘氏变形杆菌（P．pennea）、产粘液变形杆菌（P．myxofaciens）和 P．hauseri[1]。 美国药典（USP<1111>）、欧洲药典（EP 5.1.4）对变形杆菌属有明确的检测要求，我国CHINET监测（中国细菌耐药性监测）也将变形杆菌属列为监测菌类之一。变形杆菌还是引起食源性疾病的重要病原之一[2]。“迁徙生长现象”是变形杆菌在合适条件下固有的生长特性，无论在国内外微生物学经典论著[1，3-4]，还是在文献上[5-8]都有明确的描述，而该属细菌也因此而命名。但经文献和标准检索，尚未发现将“迁徙生长现象”应用于变形杆菌属检测鉴定的文献和技术规范，可能的原因是在通常的培养条件下，这种特性并非能够一直表现得那么稳定和典型。笔者根据经验积累，并通过摸索，创新性地开发了 “克氏双糖铁长斜面迁徙生长试验”，能使变形杆菌的“迁徙生长现象”特性稳定、典型表现，而且易于判断。笔者采用多种细菌菌株、人工染菌模拟样品等，验证了该方法能够有效地应用于变形杆菌的初筛检验。

2 材料与方案

2.1 试验材料

本研究共选用了96株实验用菌，包括60株变形杆菌实验菌株和36株非变形杆菌实验菌株，其中，有购自ATCC（美国菌种保藏中心）、CMCC（中国医学细菌保藏管理中心）、CICC（工业微生物菌种保藏管理中心）、AS（中国普通微生物菌种保藏中心）菌种保藏中心的标准菌株，有汕头检验检疫技术中心动检实验室日常检验分离鉴定的参考菌株和其他实验室提供（经鉴定）的参考菌株。变形杆菌属实验用菌编号在文中以“P+数字”表示代号，具体见表1；非变形杆菌实验菌株主要选择生化上与变形杆菌属较为“近亲”、或环境中常见菌种，以“N+数字”表示代号，具体见表2。

表2 36株非变形杆菌实验菌株清单

2.2 主要设备与仪器、试剂

SPX-250B-Z型生化培养箱 （上海博迅实业有限公司），CLASSⅡA/B3型生物安全柜（美国FORMA公司），HV-85型自动高压灭菌器 （日本HIRAYAMA公司），细菌菌浊仪和VITEK 2 Compact微生物鉴定仪（法国生物梅里埃公司）等。

克氏双糖铁干粉培养基（同时选用了3个厂家：北京陆桥技术有限公司、广东环凯科技有限公司、青岛日水生物技术有限公司的产品；制成克氏双糖铁长斜面，在下文简称北克、广克、青克）、脑心浸液干粉培养基（BAI）、麦康凯培养基（MAC）、大肠杆菌显色培养基（下文简称杆显）、营养琼脂（NA）、血平板等均购自广东环凯科技有限公司，API 20E生化试剂盒、氧化酶试剂、革兰氏染色液均购自法国生物梅里埃公司，无抑菌剂、无表面活性剂化妆品基础膏（下文简称基质）购自广东金奇日化有限公司。

3 实验方法

3.1 实验菌株的迁徙生长试验

（1）按标准GB 4789.28的要求配制克氏双糖铁长斜面培养基（底层高度约2cm、斜面长度约6cm），在2周时间内使用。3个厂家的干粉培养基按配制比例制成的斜面（北克、广克、青克）后，在斜面的底部与试管壁之间都有约100 μL冷凝液，通常放置4℃冰箱4周内不会完全变干。

（2）所有实验菌株均从磁珠冻存管各取1颗放入10 mL BAI中、置于 36±1℃复苏增菌约 18 h，肉汤浊度均达2。

（3）用移液枪分别吸各菌种500 μL菌液，小心地将吸管伸入到斜面底部冷凝液中轻轻接入菌液，操作时移液枪吸头不能碰到培养基，3个厂家的克氏双糖铁长斜面同时接种操作。置于36±1℃、培养24 h和 48 h。

（4）斜面菌苔的验证：分别用接种环在所有实验菌株的克氏双糖铁斜面顶往下≤1 cm位置斜面的表面做向上刮取动作2次，分别划线接种于血平板，置于36±1℃培养24 h和48 h。

3.2 迁徙生长试验的灵敏度试验

选择 P1、P3、P5、P7 4 株普通变形杆菌；P8、P9 2 株潘氏变形杆菌；P10、P21、P27、P28、P29、P31 6株奇异变形杆菌共12株作为代表菌株，做迁徙生长鉴定法的灵敏度试验。

分别挑取上述12株代表菌的菌苔，各制出1.0麦氏度的菌浊液，然后以10倍数稀释，分别取10-6、10-7、10-8、10-9稀释液进行检测。按2.1的方法操作，置于36±1℃培养24 h。上述操作的同时，各菌株稀释液按吸取量500 μL菌液进行菌落计数。

3.3 人工染菌模拟化妆品样品试验

3.3.1 检测样制作

选部分代表性实验菌菌苔调制成1.0麦氏度菌液，参照《化妆品安全技术规范》[9]的增菌方法，以“无表面活性剂化妆品基础膏（基质液）0.5 g+干扰菌N 各 50 μL+变形杆菌 P 50 μL+SCDLP 4.5 mL”混合均匀，制出若干检测模拟化妆品样品增菌液（详见表3），按2.1在3种培养基（北克、广克、青克）上进行迁徙生长试验。

表3 人工染菌模拟化妆品样品配方列表

3.3.2 斜面菌苔的验证

按2.1的方法，分别将菌苔醮取物划线接种于MAC、杆显平板，36±1℃培养24 h后观察平板上菌落特点。

4 结果与分析

4.1 实验菌株迁徙生长试验

结果见表4。变形杆菌和非变形杆菌迁徙生长试验典型结果见图1。接种变形杆菌的克氏双糖铁长斜面，肉眼可见整个斜面被漫延性生长 （四周扩散）的灰白色菌苔基本覆盖，呈阳性反应；而接种非变形杆菌的，菌株都未表现出向上的蔓延生长，有个别菌株出现了沿斜面向上浸润生长 （液体附在固体表面上的渐渐渗入）的现象，其向上生长的菌苔没有超过冷凝液面上1 cm（低于1/4斜面高度），呈阴性反应。阳性与阴性的迁徙试验结果区分度明显。

（续表4）

图1 变形杆菌和非变形杆菌迁徙生长试验典型结果

斜面菌苔的验证结果：培养24 h、48 h后，在所有变形杆菌实验菌株的血平板上均出现覆盖膜样生长的菌苔，并有恶臭味，所有非变形杆菌实验菌株的血平板上均无菌生长。

4.2 迁徙生长试验的灵敏度试验

迁徙生长试验的灵敏度试验结果见表5。其中，P9号菌株迁徙生长试验的灵敏度试验结果见图2。由表5可见，在菌落计数为10 CFU/500 μL以下时，迁徙生长试验仍能呈现阳性结果。

表5 迁徙生长试验的灵敏度试验结果（CFU/500 μL）

图2 P9号菌株迁徙生长试验的灵敏度试验结果

4.3 人工模拟样品迁徙生长试验结果

4.3.1 试验结果

试验结果见表6、图3。由表6、图3可见，干扰菌对模拟样品中变形杆菌迁徙试验结果没有影响。

表6 人工染菌模拟样品迁徙生长试验结果

图3 人工模拟样品迁徙生长试验结果

4.3.2 斜面菌苔验证结果

12个样品划线接种于MAC、杆显平板培养24 h后，生长良好，在MAC平板上均为形态一致的无色半透明或透明、圆形菌落，大小1～2 mm，菌落生长处平板颜色由桔黄色变无色；在杆显平板上均为形态一致的桔黄色至浅褐色菌落，大小1～3 mm，菌落生长处的培养基有的会变成黄色。经生化鉴定分离菌都符合所加入的变形杆菌生化特征。

5 结论与讨论

《伯杰氏细菌鉴定手册》第8版[3]中第八部分肠杆菌科变形菌属中，虽然没有将“迁徙生长现象”在变形菌属予以描述，但手册的补充评注中将普通变形杆菌（P．vulgaris）和奇异变形杆菌（P．mirabilis）清楚描述“在固体培养基上有显著的自发群集的特性；运动细胞的一薄层以旋转和带状的改变排列……”；虽然该版本将没有“迁徙生长现象”特性的摩氏变形杆菌、无恒变形杆菌、雷氏变形杆菌也划归为变形杆菌属，但作为《伯杰氏细菌鉴定手册》更新版的《伯杰氏系统细菌学手册》第2版[4]，将他们同时分别归类为摩根氏菌属、普罗威登斯菌属、雷特菌属，称为同模式异名（homotypic synonym）。本研究结果显示这种“迁徙生长现象”是变形杆菌属中普通变形杆菌、奇异变形菌、潘氏变形杆菌固有的，与其他细菌明显不同的特征性特点。

本试验应用克氏双糖铁培养基（乳糖∶葡萄糖为10∶1）而没有应用TSI三糖铁培养基（乳糖∶蔗糖∶葡萄糖为10∶10∶1），是因为后者比前者多含蔗糖，普通变形杆菌和潘氏变形杆菌都能分解蔗糖使斜面变黄、部分菌株除产硫化氢还会出现底层培养基离底，而奇异变形杆菌因不能分解蔗糖斜面为橘红色或红色；在克氏双糖铁上3种变形杆菌在斜面上都是一致的橘红色或红色，底层产酸产硫化氢但不会出现离底或培养基破裂的现象。本试验也没有像文献[10]那样采用普通营养琼脂斜面，因为变形杆菌在普通营养琼脂斜面上没有糖发酵及产酸产硫化氢特点，而且沿斜面产生菌苔迁徙生长没有克氏双糖培养基明显，对于变形杆菌的鉴定效果不好。因此，本文最终选择应用克氏双糖铁斜面作为检测载体。为了防止国产试剂配方差异导致结果不稳定，选用国内市场占有率较高的3个厂家的克氏双糖试剂制成斜面，同时进行以上3个实验。结果表明，所有变形杆菌实验菌株均从斜面底的冷凝液中向上长出灰白色菌苔，并沿斜面向上蔓延生长，可覆盖整个斜面，且“动力十足”地向下往斜面底层生长并产硫化氢，为迁徙生长试验阳性；非变形杆菌实验菌株中，多数未出现肉眼可见的向上生长现象，个别出现轻微向上浸润生长现象 （液体附在固体表面上的渐渐渗入现象），且不会超过冷凝水液面之上1 cm（小于斜面高度1/4位置），迁徙生长现象均呈阴性。迁徙生长试验的灵敏度试验结果表明，检测低限可至少达到 3～7 CFU/500 μL，与文献中 PCR 检测方法相当[11]。

变形杆菌属细菌迁徙生长的影响因素与特定的酸碱度环境等有关，它的螺纹迁徙生长现象产生可能与其遗传特性和地球的自转有关[8]、琼脂浓度和表面水分含量有关[6]、与细菌的传代次数无关[7]、35℃、培养4 h就能开始迁徙生长[12]。实验结果显示，在克氏双糖铁长斜面36±1℃、培养24 h，变形杆菌能很好地显示其迁徙生长特性。

本研究结果表明，应用本研究开发的克氏双糖铁迁徙生长试验方法，能充分展示变形杆菌的迁徙生长特性，并且能方便、明显地与其他细菌区分出来。人工染菌模拟样品试验结果表明，将化妆品样品的首次增菌液按本文方法进行迁徙生长试验，可以很方便地筛查出样品中含有的微量变形杆菌。所以，迁徙生长现象可应用于实际样品检测。本文首创的“迁徙生长试验”可应用于食品、化妆品等样品变形杆菌的初筛检测，既可以首次增菌液是否产生迁徙生长现象作为是否含有变形杆菌的初筛判断依据之一，也可以在细菌分纯培养后的迁徙生长试验阳性作为变形杆菌的特征性生化鉴定项目之一。

本研究首创的“迁徙生长试验”操作简单、成本低廉、易于判断结果，可作为变形杆菌属检测的初筛项目或特征性生化鉴定项目之一。

致谢：向为本试验提供部分实验菌种的天津医科大学第二医院感染性疾病研究所和深圳龙岗区疾控中心表示衷心感谢！

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