c-jun基因沉默对放射抗拒鼻咽癌裸鼠移植瘤生长及血管生成的影响

林国享 李龄 曲颂 余彬彬 梁忠国 孙永楚 周磊 陈凯华 卢其腾 朱小东，3

c-jun基因作为转录因子1（activating protein-1，AP-1）的重要组成部分，与细胞增殖、凋亡、迁移、侵袭等密切相关［1-2］。血管内皮生长因子（vascularendothelial growth factor，VEGF）是常见的促血管生成因子，在肿瘤血管生成过程中起核心作用。研究表明，c-jun对VEGF表达有重要调控作用［3］，可调节肿瘤组织血管生成［4-5］。本课题组前期实验通过间歇大剂量γ射线多次照射人鼻咽癌细胞CNE-2，成功构建了具有稳定放射抗拒性的人鼻咽癌放射抗拒细胞株CNE-2R［6］，并发现c-jun在人鼻咽癌放射抗拒细胞株CNE-2R中高表达［7］，沉默c-jun可抑制CNE-2R细胞增殖，并增加其放射敏感性［8］。本研究在前期实验基础上，探究c-jun基因沉默对人鼻咽癌放射抗拒细胞CNE-2R VEGF表达的影响，并构建裸鼠模型观察c-jun基因沉默对CNE-2R细胞移植瘤生长及其血管生成的影响，以期为阐明鼻咽癌发生发展机制提供参考。

1 材料与方法

1.1 主要材料

人鼻咽癌放射抗拒细胞株CNE-2R由广西医科大学附属肿瘤医院实验研究部构建并保存；IPA裂解液、BCA蛋白定量试剂盒和ECL化学发光试剂购自上海碧云天技术有限公司；兔抗人VEGF、c-jun及β-actin抗体购于美国CST公司，兔抗人CD34抗体购于福州迈新生物科技有限公司，山羊抗兔二抗购于上海碧云天技术有限公司；凝胶成像分析仪购自美国Bio-Rad公司；免疫组化试剂盒购于北京中杉生物技术有限公司。4～6周龄实验用裸鼠，18～20 g/只，均为雄性，购于上海斯莱克实验动物有限公司，在SPF条件中饲养（合格证编号：2015000530021）。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 将鼻咽癌放射抗拒细胞CNE-2R分成3组：siRNA技术介导c-jun基因沉默的c-junshRNA-CNE-2R细胞组（c-jun-shRNA组）、阴性对照NC-shRNA-CNE-2R细胞组（NC组），以CNE-2R细胞为空白对照组。细胞培养用RPMI-1640培养液（含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 mg/mL链霉素），在37℃、5%CO2培养箱中常规培养。胰蛋白酶消化传代，取对数生长期的细胞用于实验。

1.2.2 Western blot检测CNE-2R细胞VEGF蛋白的表达 收集对数期生长的CNE-2R细胞，RIPA裂解液抽提细胞总蛋白，BCA法行蛋白定量。每组细胞取20 μL蛋白质，加上样缓冲液，12%SDS-PAGE电泳、转膜、5%脱脂牛奶封闭后，分别加入相应的一抗（1∶1 000）和 β-atin抗体（1∶1 000），4 ℃孵育过夜，分别与相应HRP 标记的二抗（1∶1 000）室温摇床孵育 1 h，ECL显影，凝胶成像系统拍照和分析。以各组内参基因蛋白β-atin表达量为基准，ImageJ软件分析条带灰度值并计算各组VEGF蛋白的相对表达量。

1.2.3 裸鼠人鼻咽癌模型的建立及鉴定 细胞慢病毒转染后传代培养4周，将4～6周龄雄性裸鼠随机分成c-jun-shRNA组、NC组和空白对照组，每组5只。取对数期的各组细胞，将细胞消化并混悬调整浓度为2×107/mL，分别于3组裸鼠右腹股沟皮下注射细胞悬液0.2 mL/只。观察成瘤情况，观察肿瘤出现的时间、肿瘤体积、肿瘤大小等。2周后用游标卡尺测量裸鼠肿瘤直径，连续观察6周，游标卡尺测量肿瘤长短径，计算肿瘤体积（V），绘制肿瘤生长曲线。至第6周末处死裸鼠，完整分离瘤体并称重，计算肿瘤体积。完整瘤组织用石蜡包埋，连续切片10张，片厚5 μm，HE染色。按成瘤的裸鼠数计算成瘤率。肿瘤体积=长径（a）×短径（b）2×0.5。

1.2.4 免疫组化法检测移植瘤组织中VEGF、CD34的表达 石蜡切片常规脱蜡，枸橼酸缓冲液微波92～98℃抗原修复，3%H2O2作用10 min，加入工作液兔抗人VEGF 抗体（1∶600）、小鼠抗人 CD34（1∶100），4 ℃过夜。复温后滴加二抗，DAB显色，苏木精复染。CD34以血管内皮为阳性对照，指标均用PBS代替第一抗体作为阴性对照。

1.2.5 VEGF蛋白表达计算 VEGF蛋白表达均以细胞质或细胞膜出现棕黄色颗粒为阳性，镜下每个切片随机选取5个高倍镜视野，判断染色强度，并计算阳性细胞百分比。将染色强度分为4个等级：不着色为0分、浅黄色为1分、棕黄色为2分、棕褐色为3分。依据每个视野阳性细胞数所占百分比，划分为4个等级：0～19%为 0分、20%～39%为 1分、40%～59%为 2分、≥60%为3分。每张切片所取视野的得分取其平均值。免疫组化染色结果由2位病理科专家同时评定，以两者之积作为最终得分，0～3分定义为低表达，6～9分定义为高表达。

1.2.6 微血管密度结果判定（microvesseldensity，MVD）

CD34标记血管内皮细胞并计数微血管密度。光镜下以100倍视野选取5个微血管染色方法区（新生血管热点区），然后在200倍视野下计算每一方法区中的微血管，取其平均值，即为组织的MVD。

1.3 统计学方法

采用SPSS 17.0统计软件对数据进行分析。实验数据以均数±标准差（x±s）表示，两组间均数比较采用独立样本t检验，多组间比较采用单因素方差分析（one way ANOVA），肿瘤体积生长采用单因素重复测量方差分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 c-jun基因沉默后CNE-2R细胞中VEGF的表达

Western blot实验结果（图 1）显示，c-jun-shRNA组细胞c-jun蛋白表达较NC和空白对照组明显降低（P＜0.05），表明该组细胞c-jun基因沉默效果好，成功构建c-jun基因沉默的c-jun-shRNA-CNE-2R细胞。空白对照组VEGF蛋白的相对表达量为0.97±0.01，NC组为 0.99±0.01，c-jun-shRNA 组为0.48±0.03。与NC组及空白对照比较，c-jun-shRNA组细胞中VEGF的表达量明显下降（P＜0.05），而NC组及空白对照组差异无统计学意义（P＞0.05）。

图13 组细胞VEGF的表达

2.2 裸鼠皮下移植瘤生长情况

3组裸鼠成瘤率均为100%。在第1周、第2周，3组裸鼠移植瘤体积差异无统计学意义（P＞0.05）。c-junshRNA组裸鼠移植瘤体积增长速度缓慢，体积增长幅度较NC组和空白对照组小，第3～6周c-jun-shRNA组移植瘤体积明显小于NC组和空白对照组（P＜0.05）；整个观察期NC组及空白对照组裸鼠移植瘤体积差异无统计学意义（P＞0.05）。见表1。

表1 3 组裸鼠移植瘤体积的变化［（±s），mm3］

表1 3 组裸鼠移植瘤体积的变化［（±s），mm3］

与空白对照组比较，aP＞0.05；与空白对照组比较，bP＜0.05；与NC组比较，cP＜0.05

测量时间 空白对照组（n=5） NC组（n=5） c-jun-shRNA组（n=5）第 2 周 157.23±23.78 160.16±45.23a 155.98±35.56a第 3 周 301.43±78.46 296.49±100.45a 240.08±58.56bc第 4 周 509.67±78.67 498.35±99.87a 302.56±81.34bc第 5 周 835.31±45.73 805.05±65.63a 590.56±62.78bc第 6 周 1203.76±100.42 1196.81±90.69a 720.85±72.10bc

选取第2～6周5个时间点行重复测量方差分析，结果显示，组间效应有统计学意义（F=52.276，P=0.001），说明c-jun-shRNA组裸鼠移植瘤体积明显小于空白对照组及NC组；时间效应有统计学意义（F=89.437，P＜0.001），表明3组移植瘤的体积均随时间延长而增长，分组和时间具有交互作用（F=25.187，P=0.001）。

2.3 裸鼠皮下移植瘤质量的变化

6周观察期结束，处死裸鼠，剥离裸鼠移植瘤组织，称取其质量，c-jun-shRNA 组质量为（0.42±0.04）g，NC组为（0.80±0.08）g和空白对照组为（0.83±0.05）g。c-jun-shRNA组移植瘤移植瘤质量较NC组及空白对照组轻（P＜0.05）；NC组与空白对照组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。

2.4 裸鼠移植瘤组织中VEGF的表达情况

镜下观察发现，VEGF阳性信号表达于组织细胞质。NC组和空白对照组VEGF阳性信号为棕褐色，表达率均≥60%，呈强阳性；而c-jun-shRNA组仅呈浅黄色或不着色，表达率约30%，呈弱阳性，见图2。c-junshRNA组移植瘤组织中VEGF表达得分为2分，NC组为6分，空白对照组为6分，c-jun-shRNA组得分明显较NC组和空白对照组低（P＜0.05）。

2.5 裸鼠移植瘤组织中CD34蛋白的表达

用CD34标记血管内皮细胞计算微血管数，免疫组化结果示，内皮细胞可见棕黄色或黄色颗粒（图3），计算血管数，c-jun-shRNA组MVD为11.69±3.30，NC组为 32.56±7.33，空白对照组为 35.45±4.87，c-junshRNA组MVD较NC组和空白对照组明显减少（P＜0.05），而空白对照组与NC组差异无统计学意义（P＞0.05）。

图2 3组裸鼠移植瘤组织中VEGF蛋白的表达（HE染色，×100）

图3 3组裸鼠移植瘤组织中CD34蛋白的表达（HE染色，×100）

3 讨论

放疗是鼻咽癌的主要治疗手段，但临床上约20%的患者治疗后发生局部复发和远处转移［9-11］，血管生成与肿瘤发生、发展及远处转移密切相关，抑制血管生成对肿瘤治疗意义重大［12］。c-jun原癌基因是即刻早期基因Jun家族成员之一，与多种细胞因子及生长因子的转录调控密切相关，在多种恶性肿瘤中呈高表达。研究表明，c-jun基因或其相关信号通路的作用改变可影响肿瘤血管生成，可能参与肿瘤形成、侵袭和转移等过程［13-15］。但目前c-jun基因对鼻咽癌影响的研究较少。

VEGF是一种重要的促血管形成因子，通过增加微血管的通透性和特异性，与血管内皮细胞受体结合，促进血管内皮细胞分裂和增殖，进而导致新生血管生成，还可以自分泌的形式促进肿瘤细胞自身生长。研究表明，VEGF在鼻咽癌组织中呈高表达，且其表达与鼻咽癌远处转移密切相关［16-17］。c-jun在VEGF的表达过程中起重要调控作用，从而调节肿瘤等组织血管生成［18］。以上研究说明，研究c-jun在鼻咽癌细胞血管生成中的作用，对抑制鼻咽癌生长、转移及治疗可能有重要作用。

本课题组前期研究［7-8］发现，沉默c-jun基因可影响CNE-2R细胞增殖、凋亡，并可提高其放射敏感性。本研究继续采用前期研究方法，采用siRNA技术将CNE-2R细胞中的c-jun基因敲除，从体内、体外两种实验模式研究c-jun在鼻咽癌生长和血管生成中的作用。裸鼠动物模型实验结果显示，随时间延长，c-junshRNA组裸鼠皮下移植瘤体积增长速度明显较阴性对照组和空白对照组慢，且增长幅度较小，可见c-jun基因沉默可抑制鼻咽癌CNE-2R细胞皮下移植瘤生长，与前期研究中沉默c-jun基因可降低CNE-2R细胞增殖的结论一致。进一步研究其可能的机制，发现沉默c-jun基因可使CNE-2R细胞中VEGF表达水平下降；裸鼠移植瘤组织切片的免疫组化结果也发现c-jun-shRNA组VEGF表达较NC组及空白对照组明显下降，说明抑制c-jun基因可使鼻咽癌组织中VEGF表达下降，提示对c-jun调控可能影响鼻咽癌肿瘤血管相关因子表达水平。进一步检测裸鼠移植瘤组织中CD34的表达情况，发现NC组和空白对照组表达均较c-jun-shRNA组高。进行血管密度分析发现，c-jun-shRNA组MVD明显低于NC组和空白对照组，再次印证c-jun可能通过影响裸鼠移植瘤血管生成，从而影响细胞增殖和组织生长。结合实验中c-jun在体内外对VEGF表达的影响，分析其作用机制可能是通过调控VEGF表达而影响移植瘤血管生成。在前列腺癌研究［19］中亦发现通过调节c-jun相关通路，可改变c-jun表达，从而影响前列腺癌生长及肿瘤血管生成。Shen等［20］研究表明c-Jun氨基末端激酶激活可通过调控VEGF表达而诱发血管生成，而cjun下调可降低肿瘤生长［21］，以上研究结果均与本实验结果相符。

综上所述，c-jun基因沉默可抑制人鼻咽癌放射抗拒性肿瘤生长，通过降低VEGF表达可能抑制肿瘤血管生成。对c-jun基因与鼻咽癌放射抗拒关系的深入研究，或可为鼻咽癌放疗提供新的思路。

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