不同壁材对乳化溶剂蒸发法制备南极磷虾油纳米乳的影响

张 建 润, 张 晶, 宋 亮,2, 王 枭, 栗 冰 莹, 周 大 勇,2

( 1.大连工业大学 食品学院， 辽宁 大连 116034；2.大连工业大学 国家海洋食品工程技术研究中心， 辽宁 大连 116034 )

0 引 言

南极磷虾油富含磷脂型多不饱和脂肪酸和酯型虾青素[1]，具有降血脂、降血压、抗氧化等活性，有较高的开发利用价值[2]。磷脂型多不饱和脂肪酸和酯型虾青素是南极磷虾油的特色功能性成分，但稳定性差，南极磷虾油易失去活性[3]。此外，南极磷虾油腥味较重，水溶性较差，限制了其在食品领域的应用。

包埋载体技术可改善水溶性和提高稳定性，但粒径较大且功能活性物质损耗较高，食品工业迫切需要新的包埋技术，因此多种纳米包埋技术应运而生[4]。乳化溶剂蒸发法是将与水互溶的溶剂作为水相，与水不互溶的有机溶剂作为油相，水相与油相接触时会形成纳米乳[5]，在制备的过程中不会产生高温，可以更好地保留虾青素等热敏性功能组分。已有文献报道采用乳化溶剂蒸发法制备纳米乳(粒)，但主要集中在载药体系的研究[6]。目前对于此方法主要侧重于制备工艺优化的探讨，对制备前后油脂组分变化及南极磷虾油纳米乳鲜有报道。

本研究采用乳化溶剂蒸发法制备南极磷虾油纳米乳，检测包埋率、粒径、分散指数、Zeta电位、微观形态、热稳定性及脂肪酸组成及相对含量等指标确定最佳壁材。以期为南极磷虾油纳米乳的制备提供简便有效的方法，提高南极磷虾油功能组分的稳定性，进一步提升南极磷虾油产品的品质。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

南极磷虾油，大连辽渔集团有限公司提供冻干南极磷虾，实验室自提虾油；酪蛋白酸钠、大豆分离蛋白、硬脂酸、玉米醇溶蛋白，上海生工试剂有限公司；阿拉伯胶、吐温-20，天津大茂试剂有限公司；正己烷、甲醇，色谱级，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；其他试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

T-25型匀浆机，德国IKA集团；PandaPLUS 2000高压均质机，意大利GEA公司；SU-8010型电子扫描显微镜，日本日立集团；Mastersizer 2000激光粒度仪，英国马尔文集团；μSC差示扫描微量热仪，法国SETARAM公司；Agilent 7890A气相质谱仪，美国Agilent公司。

1.3 方 法

1.3.1 南极磷虾油的提取

将南极磷虾与正己烷按料液比1∶15混合，在37 ℃下搅拌1 h，随后静置12 h，收集上清液，旋蒸除去正己烷得到南极磷虾油，充氮密封。

1.3.2 南极磷虾油纳米乳的制备

1.3.2.1 水相的制备

以乳清分离蛋白为壁材，将1%的吐温-20与乳清分离蛋白按质量比1∶1溶于0.01 mol/L、pH 7的PBS缓冲液中；以酪蛋白酸钠为壁材，将2.5%稳定剂(65%酪蛋白酸钠，6%阿拉伯胶，29%吐温-20)溶于PBS缓冲液；以硬脂酸为壁材，1%蔗糖脂溶于PBS缓冲液;以玉米醇溶蛋白为壁材,将3%的吐温-20溶于0.01 mol/L、pH 4的PBS缓冲液。

1.3.2.2 油相的制备

以乳清分离蛋白为壁材，将0.3 g南极磷虾油溶于20 mL乙醇溶液；以酪蛋白酸钠为壁材，将0.3 g南极磷虾油溶于20 mL乙醇溶液[7]；以硬脂酸为壁材，将0.3 g南极磷虾油与0.3 g硬脂酸结合溶于20 mL乙醇溶液；以玉米醇溶蛋白为壁材，将0.3 g南极磷虾油与1.5 g玉米醇溶蛋白溶解在30 mL 85%的乙醇[8]。

1.3.2.3 纳米乳的制备

将油相与水相按体积比1∶9混合，40 ℃搅拌1 h，在6 000～10 000 r/min匀浆5～10 min；在0、30、60 MPa压力下分别均质1次，在 80 MPa 压力下循环均质3次，旋蒸除去乳液中的有机溶剂，得到纳米乳[9]。

1.3.3 纳米乳包埋率的检测

采用气相色谱法，以EPA作为标准品得到标准曲线，其回归方程为y=445 866x-4×106，R2=0.991 6。

称取2 g样品，加入15 mL石油醚，90 r/min振荡30 min提取表面油[9]；称取2 g样品溶解到12 mL去离子水中，37 ℃恒温振荡0.5 h，加入4 mL 氨水，再依次分别加入16 mL乙醇、石油醚与正己烷，恒温振荡0.5 h，8 000 r/min离心10 min，提取上清液，旋蒸除去有机溶剂得到总油。分别测定总油与表面油中EPA的质量分数，计算纳米乳包埋率[10]：

包埋率=(wt-w)/wt×100%

式中：wt为总油中EPA质量分数，w为表面油中EPA的质量分数。

1.3.4 纳米乳粒径分布、分散指数、Zeta电位的测定

将纳米乳溶于去离子水中，按体积比1∶20进行稀释，采用激光粒度仪测定粒径、分散指数及Zeta电位。实验温度为25 ℃，探测角度为90°，实验重复3次，结果通过Mastersizer 2000软件进行分析。

1.3.5 扫描电镜观察

取适量冻干样品进行扫描电镜分析，加速电压为3 kV。

1.3.6 差示扫描量热分析

将纳米乳冻干样品100 mg置于铝锅中密封，以空铝锅作为空白对照，重复测定3次。样品从20 ℃加热至100 ℃，再冷却至10 ℃，速率为1 ℃/min[4]。通过Processing软件对数据进行分析。

1.3.7 脂肪酸组成及相对含量测定

采用文献[11]的方法检测并分析南极磷虾油与包埋油中脂肪酸的组成及相对含量。

1.3.8 数据处理方法

实验数据均以(平均值±标准偏差)表示，采用SPSS16.0软件对所得数据进行单因素方差分析，在P<0.05时认为有统计学差异。

2 结果与讨论

2.1 包埋率

经过计算以乳清分离蛋白、酪蛋白酸钠、硬脂酸、玉米醇溶蛋白为壁材制备纳米乳包埋率分别为(76.45±1.96)%、(76.03±1.27)%、(78.82±1.35)%、(63.95±1.56)%。结果表明，前三者无显著性差异(P>0.05)，均在76%以上；而以玉米醇溶蛋白为壁材制备纳米乳包埋率最低(P<0.05)，说明以乳清分离蛋白、酪蛋白酸钠、硬脂酸作为壁材对南极磷虾油的包埋效果好，结合能力强，可以更好地进行包埋。

2.2 粒径、分散指数与Zeta电位

不同壁材制备南极磷虾油纳米乳粒径分布如图1所示。以乳清分离蛋白、酪蛋白酸钠、硬脂酸和玉米醇溶蛋白为壁材，制备的纳米乳平均粒径分别为(113.48±3.17)、(141.92±3.38)、(5 606.43±131.08)、(197.24±6.02) nm；分散指数分别为0.371、0.359、1、0.489。结果表明，以乳清分离蛋白、酪蛋白酸钠和玉米醇溶蛋白为壁材制备纳米乳的粒径达到纳米级，分散性能较为稳定，纳米颗粒不易发生凝聚产生沉淀。纳米乳粒径越小，表面积越大，稳定性越低[12]；而在相同粒径尺寸下，分散指数越小，稳定性越强[13]。分散指数表示溶液中的分散程度，分散指数在0.2～0.5，说明纳米乳分散效果较好。以乳清分离蛋白、酪蛋白酸钠及玉米醇溶蛋白作为壁材制备纳米乳分散性较好，而以硬脂酸为壁材制备的纳米乳，在溶液中已经聚集，分散性较差。

不同壁材制备南极磷虾油纳米乳的Zeta电位结果如图2所示。以乳清分离蛋白、酪蛋白酸钠、硬脂酸、玉米醇溶蛋白为壁材制备纳米乳，Zeta电位分别为(-4.25±1.91)、(-22.65±3.32)、(-61.95±0.49)、(-32.3±3.39) mV。以乳清分离蛋白为壁材制备纳米乳，电荷较低，相互排斥作用较弱，容易出现聚集现象，产生沉淀；而以其他3种材料为壁材制备纳米乳，均带有不同程度的负电荷，同种电荷互相排斥，不会产生聚沉现象，并且由于纳米乳粒径较小，受到重力作用较弱，布朗运动可以使其平衡，具有较好的稳定性[6]。

MAO等[14]采用乳清分离蛋白为壁材制备的类胡萝卜素油脂纳米乳，其粒径为(132.0±2.5) nm，Zeta电位为(-7.14±0.7) mV；Ilyasoglu 等[15]采用酪蛋白酸钠为壁材制备鱼油纳米乳，其包埋率为(78.88±2.89)%，粒径为232.2 nm，Zeta电位为-25 mV；Parris等[16]采用玉米醇溶蛋白为壁材制备玉米油纳米乳，粒径为100 nm，Zeta电位为-30 mV；Zhu等[10]采用硬脂酸为壁材制备南极磷虾油纳米乳，粒径为 143.5 nm，Zeta电位为-57.4 mV。本研究采用3种蛋白为壁材制备的南极磷虾油纳米乳，其表征参数与文献报道的结果相接近。蛋白质与芯材的亲和力对纳米乳的形成较为重要，不同种类壁材的乳化活性和稳定性不同，对制备的纳米乳粒径大小具有一定影响[16]。而本研究采用硬脂酸为壁材制备的南极磷虾油纳米乳与文献[10]的报道结果有较大的差异，可能是由于在其制备的过程中采用不同的乳化剂所致。

(a) 乳清分离蛋白

(b) 酪蛋白酸钠

(c) 硬脂酸

(d) 玉米醇溶蛋白

(a) 乳清分离蛋白

(b) 酪蛋白酸钠

(c) 硬脂酸

2.3 微观形态

通过扫描电镜观察4种壁材制备纳米乳的形态，如图3所示。以乳清分离蛋白、硬脂酸、玉米醇溶蛋白为壁材制备的纳米乳，形态均为片状，可能是南极磷虾油与不同壁材的结合程度不同，在乳化过程中发生了一定程度的聚集；或者由于冻干过程脱水导致制备的纳米乳发生聚集，形成片状结构。而以酪蛋白酸钠为壁材制备的纳米乳，形态为直径100 nm左右的球形，在冻干过程中，壁材含有的亲水与疏水基团不会使其产生聚集。

(a) 乳清分离蛋白

(b) 酪蛋白酸钠

(c) 硬脂酸

(d) 玉米醇溶蛋白

2.4 热稳定性

不同壁材制备的南极磷虾油纳米乳样品的热稳定性如图4所示。以乳清分离蛋白和酪蛋白酸钠为壁材，在升温过程中出现两个峰，表明生成两种晶体，即α-晶体和β-晶体[16]，最高可承受温度分别为(44.46±0.74)和(62.84±0.53) ℃(图4(a)、(b))；以硬脂酸和玉米醇溶蛋白为壁材，在升温过程只出现一个峰，表明只生成一种晶体，即α-晶体，最高可承受温度分别为(62.22±0.01)和(28.72±0.62) ℃(图4(c)、(d))。α-晶体分子排列无序，而β-晶体分子排列有序，α-晶体融化温度低于β-晶体[4,17]。以乳清分离蛋白和酪蛋白酸钠为壁材制备纳米乳，均生成了β-晶体，其中酪蛋白酸钠为壁材制备纳米乳的承受温度较高，其热稳定性较好。以玉米醇溶蛋白为壁材制备纳米乳只生成了α-晶体，其最高可承受温度较低，热稳定性较差。而以硬脂酸为壁材制备纳米乳，虽只生成α-晶体，但其最高可承受(62.22±0.01) ℃，推测是由于硬脂酸是饱和脂肪酸形成晶体可承受的温度较高，与文献[4,10]结果相近。酪蛋白酸钠在加热过程中会使丝氨酸磷酸基团丢失，使得酪蛋白酸钠与酪蛋白酸钠之间相互作用增强[18]，承受温度提高。

(a) 乳清分离蛋白

(b) 酪蛋白酸钠

(c) 硬脂酸

(d) 玉米醇溶蛋白

2.5 脂肪酸组成及相对含量

南极磷虾油纳米乳中脂肪酸组成与相对含量如表1所示。以酪蛋白酸钠为壁材，多不饱和脂肪酸相对含量最高(P<0.05)；以玉米醇溶蛋白和乳清分离蛋白为壁材，多不饱和脂肪酸相对含量次之。以酪蛋白酸钠为壁材，EPA和DHA相对含量最高(P<0.05)；玉米醇溶蛋白和乳清分离蛋白为壁材，EPA和DHA相对含量次之；而以硬脂酸为壁材，EPA和DHA相对含量最低(P<0.05)。同时，与南极磷虾油相比较，以酪蛋白酸钠为壁材制备纳米乳，多不饱和脂肪酸，尤其EPA和DHA相对含量均未发生明显下降。酪蛋白酸钠作为壁材包埋南极磷虾油，纳米乳中脂肪酸组成和相对含量与南极磷虾油最接近，酪蛋白酸钠中含有的亲水基团与疏水基团可与南极磷虾油进行结合，达到最佳效果。

表1 不同壁材制备南极磷虾油纳米乳中脂肪酸组成及相对含量

3 结 论

采用乳清分离蛋白、酪蛋白酸钠、硬脂酸和玉米醇溶蛋白4种壁材，基于乳化溶剂蒸发法制备了南极磷虾油纳米乳。结果表明，以酪蛋白酸钠为壁材制备的南极磷虾油纳米乳，包埋率为(76.03±1.27)%，粒径为(141.92±3.38) nm，Zeta电位为(-22.65±3.32) mV，分散系数较小；纳米乳形态最好，为球形纳米粒，可承受温度最高，热稳定性最好。脂肪酸组成及相对含量分析发现，与南极磷虾油相比较，以酪蛋白酸钠为壁材制备的纳米乳中多不饱和脂肪酸相对含量，尤其是EPA和DHA相对含量均未见下降，可较好保留南极磷虾油功能组分。

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