丙烯腈暴露对大鼠脑组织损伤及iNOS/p38 MAPK信号通路关键蛋白表达的影响

罗波艳, 张瑞萍, 王珂, 魏琳颜, 赵粉线, 薛红丽, 李芝兰,*

1. 兰州大学公共卫生学院, 兰州 730000 2. 宝鸡市疾病预防控制中心，宝鸡 721006

丙烯腈(acrylonitrile，ACN)是一种被广泛用于工业、高分子材料及生活日用品等方面的生产原料。国际癌症组织(IARC)已于1999年将ACN的致癌性归为2B类，即为“可能致癌物”[1]。大量研究表明，ACN可对机体多个系统造成损伤，其中神经系统毒性是ACN毒作用出现最早、最为突出的毒性表现之一[2-4]。

作为细胞间信号转导的一种重要物质，一氧化氮(nitric oxide，NO)可参与机体各种生理、病理过程。有研究报道，NO代谢水平变化与帕金森等神经退行性疾病的发生相关[5-6]，且过量的NO可使神经系统诱发癫痫，引发脑损伤和记忆缺损等[7]。体内NO含量受一氧化氮合酶(nitric oxide synthase，NOS)水平的调控。NOS又包括内皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase，eNOS)、神经型一氧化氮合酶(neuronal nitric oxide synthase，nNOS)和诱导型/免疫型一氧化氮合酶(inducible or immunological nitric oxide synthase，iNOS)3种，其中iNOS主要作为神经递质与神经调质，参与信息传递[8]，eNOS和nNOS负责维持体内正常生理水平的NO生成[9]。当机体受到炎症、免疫微生物等刺激时，会激活iNOS在巨噬细胞和中性粒细胞等细胞上的表达，继而诱导机体产生和释放大量NO[10]，导致组织损伤和发生细胞凋亡[11]。因此，iNOS/NO含量的高低对神经系统的功能正常与否起着重要的作用。此外，p38 MAPK信号通路在MAPK信号通路中扮演着非常重要的角色，其在细胞凋亡、细胞因子产生、转录调节等机制中发挥着重要作用[12]。

有研究结果显示，N-乙酰半胱氨酸(N-acetylcysteine，NAC)可以干预ACN对神经细胞诱导的损伤[13]。因此，本研究拟用不同剂量ACN对雄性SD大鼠进行灌胃染毒，检测脑组织NO含量及iNOS和p38 MAPK蛋白表达，同时设立NAC干预组，观察NAC对ACN产生的大鼠脑组织毒性作用的干预作用，以期为ACN诱导的大鼠神经系统毒性机制深入研究提供依据。

1 材料与方法(Materials and methods)

1.1 实验动物及分组

选取由甘肃中医药大学医学实验动物中心提供的50只SPF级成年健康雄性SD大鼠(动物合格证号为SCXK(甘)2011-0001)，体重250～300 g，全程饲养于甘肃中医药大学医学动物实验中心(设施合格证号：SYXK(甘)2011-0001)。实验室昼夜交替照明，温度为(22±1) ℃，湿度为50%。大鼠可自由摄食饮水。适应性饲养一周后，将大鼠随机分为5组，分别以低(12.5 mg·kg-1)、中(25.0 mg·kg-1)、高(50.0 mg·kg-1)剂量ACN对大鼠进行灌胃染毒，对照组大鼠用玉米油进行灌胃，另设NAC干预组，即先用300.0 mg·kg-1NAC给大鼠进行灌胃，30 min后再用50.0 mg·kg-1ACN对大鼠灌胃染毒，1次·天-1，6天·周-1，共连续灌胃染毒13周。末次染毒结束后，次日心脏采血后处死大鼠。

1.2 药物及试剂

ACN(纯度>99%)购买于天津四通化工厂，NAC购买于美国Amersco公司，NO和NOS试剂盒购买于南京建成生物工程研究所，BCA蛋白浓度测定试剂盒(增强型)购买于上海碧云天生物有限公司，iNOS购买于武汉Proteintech公司，eNOS、nNOS购买于美国SAB公司。β-Tublin、HRP标记山羊抗兔/抗鼠购买于武汉伊莱瑞特公司，p-p38和p38购买于美国CST公司。低温高速离心机(美国BECKMAN COULTER公司)，可见光分光光度计(上海精科有限公司)，酶标仪(美国Bio Tek公司)，电泳、转膜和凝胶成像曝光仪(美国BIO-RAD公司)。

1.3 脏器系数测定

末次染毒结束后，次日对大鼠进行称重，测量3次，求取大鼠的平均体重值。心脏采血后处死大鼠，将脑组织置于盛有0.86%生理盐水的玻璃平皿中进行冲洗，干净后用滤纸拭干，称量3次，求取大鼠的脑组织平均湿重。用脑组织平均湿重和大鼠平均体重计算脏器系数(脏器系数(%)=脏器湿重(g)/ 体重(g)×100%) 。

1.4 NO含量及总NOS水平的测定

严格按照南京建成NO和总NOS测定试剂盒说明书的检测要求，对脑组织中NO含量和总NOS水平进行检测。并用碧云天BCA蛋白浓度测定法对大鼠脑组织蛋白含量进行定量检测。

1.5 iNOS、eNOS、nNOS和p38、p-p38蛋白Western blot测定

从-80 ℃冰箱取出冻存的大鼠脑组织，按脑湿重(mg)与RIPA体积(μL)比为1:10的比例加入适量的高效RIPA裂解液，并按RIPA体积与PMSF体积比为100:1准确吸取PMSF，在冰水浴中对其进行充分研磨，然后置于EP管中予以标记。检测磷酸化蛋白时，在研磨前按磷酸酶抑制剂体积与RIPA裂解液体积比为1:100的比例，准确加入磷酸酶抑制剂。以4 ℃、12 000 g·min-1对脑匀浆进行离心，离心15 min。吸取上清，分装20 μL上清液用于BCA法测定蛋白含量，剩余上清液按每管100 μL分装至EP管，加入适量的RIPA裂解液和5×上样缓冲液，封口、标记后将EP管置于沸水中持续煮沸5 min，使脑组织蛋白样品充分变性。然后按每条泳道蛋白含量为60μg进行SDS-PAGE电泳，根据彩虹蛋白Marker标识的位置，将凝胶蛋白转移到PVDF膜上，封闭2 h，然后分别加入iNOS(兔抗，1：400)、eNOS(鼠抗，1:500)、nNOS(兔抗，1:1 000)、β-Tublin(兔抗，1:1 000)、p38(鼠抗，1:1 000)、p-p38(兔抗，1：500)，室温孵育过夜，然后选择对应的HRP标记的抗兔/抗鼠二抗，孵育2 h。最后加入适量ECL发光液，用凝胶成像仪进行曝光，保存条带。采用Image J图像分析软件对蛋白条带的灰度值进行分析。

1.6 统计分析

2 结果(Results)

2.1 ACN对大鼠体重和脑组织湿重及脏器系数的影响

从染毒第6周开始，观察到ACN各剂量组大鼠开始出现躁动、易激怒、轻度流涎等表现。单因素方差分析结果显示，与对照组比较，高剂量组大鼠脑湿重显著降低(P<0.05)。各剂量组大鼠体重与对照组相比较均升高，差异均无统计学意义(F=1.847，P=0.159)。随着ACN染毒剂量增加，大鼠脑脏器系数逐渐降低(F=3.427，P=0.027)，且ACN各剂量组脑脏器系数均显著低于对照组(P<0.05)。经NAC干预后，NAC组大鼠脑湿重、体重及脏器系数与高剂量组比较差异均无统计学意义(P>0.05)。结果详见表1。

2.2 ACN对大鼠脑组织NO含量和总NOS水平的影响

随着ACN染毒剂量增加，大鼠脑组织NO含量和总NOS活力均不断上升(F=8.528，P=0.000；F=3.422，P=0.028)。实验结果显示，高剂量组大鼠脑组织NO含量显著高于对照组和低剂量组(P<0.05)。与对照组相比，ACN各剂量组大鼠脑组织总NOS活力均显著升高(P<0.05)。经NAC干预后，与NAC组相比，高剂量组大鼠脑组织NO含量降低，总NOS水平升高，但其差异均无统计学意义(P>0.05)。详见表2。

表1 丙烯腈(ACN)慢性染毒对大鼠脑组织、体重及脑脏器系数的影响Table 1 Effects of the chronic exposure of acrylonitrile (ACN) on brain tissues, body weights and the relative organ weights of the brain tissues in rats (n=5,

注：与对照组比较，*P<0.05; NAC为N-乙酰半胱氨酸。

Note: Compared with control group,*P<0.05; NAC stands for N-acetylcysteine.

2.3 ACN对iNOS、nNOS和eNOS蛋白表达水平的影响

Western blot结果显示，与对照组比较，高剂量组大鼠脑组织iNOS蛋白和nNOS蛋白表达水平均显著升高(P<0.05)，eNOS蛋白表达水平显著降低(P<0.05)。经NAC干预后，与高剂量组比较，NAC组大鼠脑iNOS蛋白表达水平显著升高(P<0.05)，eNOS蛋白表达水平显著降低(P<0.05)，nNOS蛋白表达水平升高(P>0.05)。结果详见表3和图1-A。

2.4 ACN对大鼠脑组织p38蛋白及其磷酸化蛋白的表达水平的影响

Western blot结果显示，与对照组比较，高剂量组大鼠脑组织p-p38蛋白和p38蛋白表达水平均显著升高(P<0.05)，且p-p38/p38比值也显著升高(P<0.05)。经NAC干预后，与高剂量组比较，NAC组大鼠脑组织p-p38和p38蛋白表达水平及p-p38/p38比值均显著降低(P<0.05)。结果详见表4、图1-B。

表2 ACN慢性染毒对大鼠脑组织NO含量和总NOS活力的影响Table 2 Effects of the chronic exposure of acrylonitrile (ACN) on the contents of NO and the activities of total nitric oxide synthase (tNOS) in rats brain tissues

注：与对照组比较，*P<0.05。

Note: Compared with control group,*P<0.05.

表3 ACN慢性染毒对大鼠脑组织NOS各亚型蛋白表达水平的影响Table 3 Effects of the chronic exposure of ACN on the protein expression level of three subtypes of NOS in rats brain tissues

注：与对照组比较，*P<0.05；与NAC组比较，#P<0.05。

Note: Compared with control group,*P<0.05; compared with NAC group,#P<0.05.

表4 ACN慢性染毒对大鼠脑组织p38蛋白及其磷酸化蛋白表达水平的影响Table 4 Effects of the chronic exposure of ACN on the protein expression level of p38 and p-p38 proteins in rats brain tissues

注：与对照组比较，*P<0.05；与NAC组比较，#P<0.05。

Note: Compared with control group,*P<0.05; compared with NAC group,#P<0.05.

图1 ACN慢性染毒对大鼠脑组织NOS亚型蛋白及p38、p-p38蛋白变化的免疫印迹分析Fig. 1 Effects of the chronic exposure of ACN on the immunoblotting analysis of change of three subtypes of NOS, p38 and p-p38 proteins in rats brain tissues

3 讨论(Discussion)

脏器系数不仅可以反映化学毒物对机体的亚慢性毒性效应以及对脏器的综合毒性，而且可提供寻找毒物作用的靶器官的线索，对评价外源化学物的毒性具有灵敏性、有效性、经济性[14]。本实验中，ACN低、中、高剂量组大鼠脑脏器系数均显著低于对照组，说明ACN对大鼠脑组织产生了慢性毒作用，这可能与脑组织是ACN毒作用的靶器官有关。有研究认为机体组织脏器系数降低，提示该组织可能出现了脏器萎缩、退行性变化[15]。本研究结果提示ACN灌胃染毒13周对大鼠神经系统产生了慢性毒作用，脑组织出现了萎缩和退行性变化。

NO是一种极不稳定的生物自由基，可快速通过生物膜进行扩散。虽然NO对神经系统功能的维持是必需的，其在突触可塑性、神经调节和其他生理作用中也是不可替代的，对神经系统具有保护作用，但NO含量升高，会与超氧阴离子结合，形成高活性和高毒性的过氧化亚硝酸盐(ONOO-)[16]，引起氧化应激和细胞损伤[17]，加之ONOO-不仅是一种强有力的酪氨酸硝化剂[18]，可能会导致抗氧化酶的亚硝基化[19]，而且还是NO的主要毒作用形式[20]，ONOO-可与H+形成ONOOH，继而分解产生的羟基自由基(·OH)可进一步通过损伤线粒体电子传递系统，对特定组织造成一定的损伤[8]。在本研究中，ACN高剂量组大鼠脑组织nNOS和iNOS蛋白表达水平显著高于对照组，eNOS蛋白表达水平显著低于对照组。同时随着ACN染毒剂量增加，大鼠脑组织tNOS水平和NO含量也均不断升高。说明ACN可以诱导大鼠脑组织nNOS和eNOS蛋白表达水平改变，并刺激炎性细胞开始释放iNOS，使iNOS水平升高，继而使tNOS水平升高，引起NO含量增加，导致脑组织产生的ONOO-生成增加，最终引起脑组织发生氧化应激和细胞损伤。NAC是氨基酸L-半胱氨酸和GSH的乙酰化前体物质，可以对抗氧化作用和氧化代谢过程。对NAC开展的动物实验研究和人群研究均表明它可以通过减少细胞外胱氨酸到半胱氨酸的转化，或者可作为一种细胞内的巯基来源，使其成为一种强大的抗氧化剂[21]。此外，它还可以通过增强谷胱甘肽-S-转移酶的活性，加之其自身也是一个强大的亲核体，可以清除体内大量的自由基[22]。与高剂量组比较，NAC组大鼠脑组织tNOS水平降低，其中iNOS蛋白表达水平显著降低，eNOS表达水平显著升高，nNOS蛋白表达水平降低，表明NAC可以干预ACN引起的大鼠脑组织炎性细胞释放iNOS，使iNOS水平降低，进而使脑组织tNOS水平降低，提示NAC可以通过降低ACN染毒大鼠脑组织ONOO-、·OH等氧化物质的水平来介导iNOS等蛋白表达水平的改变。但NAC组大鼠脑组织中NO含量与高剂量组比较升高，这可能是由于ACN染毒可引起大鼠脑组织ONOO-、·OH等自由基大量生成，加上NO本身也是一种自由基，导致300.0 mg·kg-1NAC不能完全对抗50.0 mg·kg-1ACN引起的脑组织损伤。

p38 MAPK信号通路是MAPKs家族中重要的一员，其激活途径在不同细胞中有所不同，且取决于其生理或应激水平。当脂多糖、NO等炎性刺激源出现，可刺激中性粒细胞等炎性细胞激活p38，活化后的p38进入细胞核，引起细胞核内NF-κB等相关因子磷酸化并过度表达，继而使多形核白细胞出现粘附和聚集现象，最终导致组织出现炎症损伤反应[23]。本实验中，ACN高剂量组p-p38和p38蛋白表达水平及p-p38/p38比值均显著高于对照组和NAC组，这些结果表明ACN慢性染毒可引起大鼠脑组织p-p38 蛋白表达水平升高，进而激活p38 MAPK信号通路，且NAC对ACN诱导激活的p38 MAPK信号通路具有一定的抑制作用。这可能与脑组织NO含量生成增加，使ONOO-生成增加，引起脑组织发生氧化应激，引起位于p38 MAPK信号通路上游的daf-16激活，进而调控DAF-16进入细胞核，进而激活p38 MAPK信号通路有关[24]。同时NAC可以通过对抗体内ONOO-等氧化物质水平的升高而抑制p38 MAPK信号通路的激活。

综上所述，在本实验条件下，ACN慢性染毒可引起大鼠脑组织iNOS表达水平升高，NO含量增加，并激活p38 MAPK信号通路，这可能是ACN引起中枢神经毒性作用的机制之一。抗氧化剂NAC通过降低ACN诱导的脑组织氧化应激水平从而抑制iNOS/p38 MAPK信号通路的活化，提示活性氧(ROS)可能参与iNOS/p38 MAPK信号通路的活化过程，但有待于进一步研究验证。

通讯作者简介：李芝兰(1962—)，女，硕士研究生导师，教授，兰州大学公共卫生学院儿少卫生与妇幼保健学研究所所长，研究方向为妇女劳动卫生与生殖健康。

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