纳米金属氧化物对土壤酶活性的影响研究进展

石清清，邓代莉，颜椿，蒲生彦,3,

1. 地质灾害防治与地质环境保护国家重点实验室(成都理工大学)，成都 610059 2. 国家环境保护水土污染协同控制与联合修复重点实验室，成都 610059 3. 香港理工大学土木及环境工程学系，中国香港

近年来，伴随纳米技术的飞速发展，人工纳米金属氧化物(engineered nanometal oxide particles，ENOPs，其尺度界定为1～100 nm)，如纳米TiO2、ZnO、Al2O3、Fe2O3、CeO2等，在电子、生物医药、化工催化和新材料开发等各个领域得到了广泛的应用[1]。由于ENOPs在环境中的暴露程度，其是否具有生物毒性引起了各领域专家学者的广泛关注[2]。ENOPs在生产、运输和使用过程中会不可避免地释放到土壤环境中，与土壤介质中的各种组分发生物理、化学或生物反应，这些迁移转化过程会改变纳米颗粒的团聚程度、溶解速率、粒径大小或形状、表面积、表面电荷和表面化学性质等特征，从而影响纳米颗粒的环境行为及生物毒性[3]。

土壤酶是一种具有生物催化能力和蛋白质性质的高分子活性物质[4]。土壤酶参与土壤中各种化学反应和生物化学过程，与有机物质矿化分解、矿质营养元素循环、能量转移等密切相关[5-6]。土壤酶活性不仅能反映土壤微生物活性高低、表征土壤养分转化和运移能力强弱[4]、评价土壤肥力[7]和土壤环境质量[8]，也可作为评价ENOPs土壤污染的生物学指标。ENOPs的小尺寸、高比表面积等特性会增强其在土壤中的扩散程度与迁移能力并促进与土壤游离酶或底物的的接触和作用，从而可能对土壤酶的活性产生影响[2]。

本文通过大量文献调研和分析，较系统地回顾和总结了ENOPs对土壤酶活性的影响相关研究，并对未来研究方向和重点做了展望，ENOPs与土壤酶活性间的剂量-效应关系可支撑相关环境基准的研究。

1 纳米金属氧化物概述(Nano-metal oxide particles overview)

1.1 纳米氧化物的性质与用途

纳米金属氧化物颗粒具有表面效应、小尺寸效应、量子尺寸效应和宏观量子隧道效应，表现出与同组成的微米晶体材料完全不同的热学性能、磁学性能、电学性能、光学性能、力学性能及化学活性等[9]。由于具备上述诸多特性，ENOPs已广泛应用于催化剂、遮光剂、传感器及化妆品等领域，备受研究者的关注[10]。目前常见的ENOPs主要有SiO2、TiO2、ZnO、CuO、CeO2、Fe3O4、A12O3等。比如，TiO2NPs由于具备特殊的光学性质和良好的化学稳定性、热稳定性被广泛应用于抗紫外材料、纺织、光催化触媒、防晒霜、涂料、食品包装材料、造纸及航天工业中[11]；ZnO NPs则由于其高效的UV吸收能力及对可见光的透过能力而常用于个护用品及遮光材料的制作[12]；CuO NPs由于其高温超导能力、电子相关效应及动态旋转能力被广泛应用于半导体制作、催化剂及细胞显影技术[13]。

1.2 ENOPs在土壤中的环境行为

土壤是包括ENOPs在内的各种污染物进入环境后的主要归宿，又是环境污染链中重要的传递环节。纳米金属氧化物可通过多种途径进入土壤中，如大气中ENOPs的沉降，含纳米材料工业废渣、城市垃圾的填埋、弃置，含纳米材料废水和污水灌溉等。ENOPs进入环境后，在环境介质中发生迁移转化，与环境及环境中的生物体相互作用并被吸收富集，直接或间接威胁生态系统及人类健康[14]。由于ENOPs具有广谱抑菌作用，且对生物体毒性远大于碳纳米材料，其生物安全性问题日益受到关注[15]。ENOPs在土壤中发生的主要物理变化是聚集或团聚。化学转化包括氧化还原、离子溶出、硫化与磷酸化、大分子物质或有机/无机配体的修饰。此外，土壤环境中活性最高、成分最复杂的微生物亦会对纳米颗粒的形态及环境效应产生影响。

2 对土壤酶活性的影响研究(Effects of ENOPs on soil enzyme activity)

2.1 对土壤酶活性的影响

土壤酶主要涉及氧化还原酶类、水解酶类、转移酶类与裂解酶类，来源于土壤微生物活动分泌、植物根系分泌和植物残体以及土壤动物分解，是研究土壤生态系统不可或缺的关键性指标[7,16-17]。ENOPs进入土壤环境后，会与土壤介质中的各种组分发生物理、化学或生物反应，这些转化过程会不同程度影响土壤中的生化反应进程及土壤中酶活性[18-19]。根据以往研究报道，典型ENOPs如ZnO NPs、TiO2NPs、CuO NPs、CeO2NPs及铁系纳米氧化物等对土壤酶活性的影响主要聚焦在脲酶、蔗糖酶和过氧化氢酶的活性变化上，具体见表1所示。

2.2 影响土壤酶活性的主要途径

ENOPs对土壤酶活性的影响主要通过3种途径：释放有毒金属离子、改变土壤中酶或对应底物的形态结构、损伤生物体细胞，如图1所示。ENOPs对土壤酶活性的影响可能是单一途径，也可能是2种或3种途径的共同作用。

2.2.1 释放有毒金属离子

ENOPs，特别是一些易于释放出有毒金属离子的纳米材料(如ZnO、CuO纳米颗粒)，主要通过释放金属离子影响土壤酶活性。一般情况下，ENOPs进入土壤环境后金属离子并不会完全溶出，以纳米形式存在的ENOPs与释放的有毒金属离子对土壤酶活性影响的贡献率尚不清楚。

2.2.2 改变酶或底物的形态结构

土壤酶催化功能通过蛋白质分子间相互作用来实现，由于ENOPs结构和尺寸与蛋白质分子相似，可能会引起生物学识别、反应的混淆和异常，使土壤酶的结构和功能紊乱。

图1 ENOPs对土壤酶的作用途径注：a) 释放有毒金属离子；b) 改变酶或底物的形态结构；c) 损伤生物体细胞。Fig. 1 Effects of ENOPs on soil enzymeNote: a) the release of toxic metal ions; b) alteration of the morphological structure of the enzyme or substrate; c) damage to the organism cells.

ENOPs进入土壤后，在难以溶出金属离子且不损伤土壤生物体的情况下则认为ENOPs通过改变酶或底物的形态结构作用于土壤酶。ENOPs如TiO2NPs、CeO2NPs、Fe3O4NPs等在土壤中分散性好、颗粒尺寸小、比表面积大，难以溶出且具有较高的活性，容易与底物结合并发生相互作用。Du等[2]进行原位实验时发现，外源添加纳米TiO2，土壤的钛离子含量几乎无变化，土壤蛋白酶、过氧化氢酶以及过氧化物酶受到抑制，土壤脲酶活性显著增强。有研究表明，TiO2NPs处理浓度高达1 000 mg·kg-1时，脲酶活性显著提高，磷酸酶的活性受到严重抑制[21]。在刘启明等[29]的研究中，纳米TiO2也对蛋白酶活性有抑制作用，且添加剂量越高，抑制程度越大。有研究发现实验室培养添加纳米TiO2后，激活了抗氧化酶活性，如过氧化氢酶、过氧化物酶和超氧化物歧化酶等；添加纳米CeO2后，抑制了脲酶、过氧化氢酶和FDA酶的活性，并且存在剂量效应关系[30]。方国东等[25]在向土壤施加了纳米 Fe3O4颗粒后，脲酶活性增强，并存在显著剂量效应关系。这种现象是由于脲酶是一种分子量为48万道尔顿的金属酶，含有微量的顺磁性镍等过渡金属原子或离子，起着辅基、辅酶或活性中心等作用[31]，当添加Fe3O4NPs后，脲酶分子构相在Fe3O4NPs磁性作用下会发生变形和扭曲，结构和功能被改变，从而激活了自身酶活性。

ENOPs容易与酶分子活性中心结合，妨碍酶与底物的识别与相互作用。对于TiO2NPs、CeO2NPs等在土壤中不易溶出金属离子且活性较高的纳米颗粒，与土壤中的酶分子或底物分子结合改变其形态结构，阻止酶与底物的特异性识别是这类纳米氧化物影响土壤酶活性的主要途径。

2.2.3 损伤生物体细胞

ENOPs可通过直接接触或诱导活性氧产生造成膜损伤、DNA损伤和细胞信号受阻，这些方式会直接损伤微生物或动植物体细胞，进而影响微生物或动植物分泌释放土壤酶[32]。

ENOPs造成生物体过氧化损伤是最为普遍接受的一种毒性机制[33]，过氧化损伤是由活性氧引起的膜通透性改变及膜损伤[34]。Park等[35]发现，细胞核周围存在纳米TiO2颗粒时，会诱导该区域活性氧的产生；活性氧的产生与细胞活性有很好的一致性，可以指示细胞毒性。韩爽等[36]报道了氧化铜纳米颗粒会引起细菌、藻类、酵母、老鼠及人体细胞氧化应激及DNA 损伤。Applerot等[37]发现纳米CuO能促进微生物体内产生大量活性氧，迅速消耗腺嘌呤核苷三磷酸(adenosine triphosphate, ATP)使细胞信号传导受阻，从而导致大量微生物死亡。金属氧化物颗粒进入土壤环境后，通过产生活性氧簇(ROS)，增加氧化压力，经细胞内陷、膜离子通道、细胞吞噬作用等进入细胞内部对植物根系和微生物细胞产生毒害作用[38]。细胞膜或细胞器及DNA/RNA受损后，细胞合成酶的功能受损，土壤中相应酶的合成和释放减少，进而影响其中生化反应过程。

ENOPs可以聚集在土壤微生物膜上使细胞壁凹陷，从而导致细胞膜渗透性改变。ENOPs还可能改变土壤微生物膜电位，使其细胞内自由基数量增加，影响代谢过程与土壤中酶的合成与分泌[39-40]。

3 土壤酶活性的主要调控因子(Main regulators of soil enzyme activity)

ENOPs的土壤酶活效应受颗粒本身和环境因素的影响。环境因素包括生物因子和非生物因子，生物因子主要是指土壤中的微生物和植物；非生物因子主要是指土壤的理化性质，如有机质含量、pH、水分含量等。

3.1 纳米金属氧化物的性质

ENOPs兼具金属和纳米的双重性质，已有大量研究表明，多种纳米氧化物材料具有抗菌作用[41-42]，对土壤微生物量及群落结构产生较大的扰动，影响土壤酶的合成分泌过程。

ENOPs独特的物理化学性质，如比表面、尺寸效应等会影响土壤酶的活性，但不是所有的纳米氧化物与土壤酶之间都存在显著的剂量-效应关系，应明确不同纳米氧化物的敏感酶活指标。

3.2 土壤自身理化性质

由于pH、有机质组成及含量、粘土含量及矿物质等均会对纳米颗粒的环境行为及酶活性本身造成影响，土壤的物理化学性质对纳米氧化物颗粒的土壤酶活效起着调控作用[43-45]。

相同ENOPs添加到不同类型土壤后，由于土壤理化性质的差异，纳米氧化物对土壤酶的影响也有所不同。孙影等[43]发现，将纳米TiO2添加到沙土、黑土、草炭土中后，微生物、酶、氮素含量在沙土中受到的影响最大，在草炭土中受到的影响最小，出现这种现象的原因是沙土中的有机质含量比黑土和草炭土低，进入土壤的TiO2NPs不易团聚和被有机质吸附，游离的TiO2NPs更易对土壤微生物和土壤酶活性造成影响。纳米材料分散介质中的电解质种类可以调控CeO2NPs的抗菌性[46]，不同土壤中的电解质种类有所差异，也会影响CeO2NPs在土壤中的微生物及酶活效应。ENOPs施加进入土壤内后，会在一定程度上改变土壤理化性质，间接影响土壤酶活性。金盛杨等[47]研究发现，将土壤温室培养60 d后，纳米四氧化三铁(Fe3O4NPs)和纳米氧化铁(Fe2O3NPs)处理显著降低了乌栅土铵态氮和红壤有效磷的含量，略微降低了土壤pH。

土壤理化性质，如pH、有机质含量等会影响ENOPs在土壤中的迁移转化过程，进而影响土壤中纳米颗粒的生物有效性和生物毒性。在评价ENOPs对土壤酶活性的影响过程中，需结合不同土壤的理化性质加以考量。

3.3 土壤中的生物活动

土壤中的植物及微生物活动会影响ENOPs的聚集状态和运移过程，间接改变其生物有效性和酶活效应[48-49]。

纳米氧化物进入土壤后，影响土壤微生物活动分泌与植物根系分泌，从而影响微生物数量与群落结构，进而间接影响土壤酶的活性[50]。方国东等[25]研究发现，纳米 Fe3O4对红壤中的细菌和放线菌存在激活作用，且随纳米 Fe3O4投加量的增加，激活效应逐渐增强；对红壤中的真菌有抑制作用，抑制率与纳米Fe3O4投加量呈正相关，从而激活了土壤中的淀粉酶、中性磷酸酶、脲酶和过氧化氢酶。根系分泌物是植物根系分泌或溢泌的各种离子和大量有机物质，其组成和含量随着环境而发生变化[51-52]。Xu等[53]认为由于水稻根系发达，根际土壤中存在大量的植物残体可为水解纤维素提供丰富的底物，从而促进细菌生长，缓解CuO NPs对微生物细胞的毒害作用。

特定种类的植物或微生物菌剂能在一定程度上减弱ENOPs对土壤中酶活性的影响，缓解其对生物细胞的毒害作用。对于ENOPs富集程度较高的土壤，可以考虑植物修复或微生物修复方式。

4 结语与展望(Conclusion and prospect)

目前针对ENOPs环境行为和生物毒性的研究是一个新兴活跃的研究领域，很多研究尚处于起步阶段，理论基础也相对缺乏，研究广度与深度急需拓展与加强。关于ENOPs在水环境中的行为与生物毒性的研究已较为充足，而针对土壤环境及陆生植物的相关研究还较少并亟待开展。已有的ENOPs对土壤酶活性的影响多表现为抑制作用，但具体作用类型及程度受ENOPs的性质、土壤理化性质以及土壤生物活动三者的调控。研究纳米氧化物与土壤酶间的剂量-效应关系可为相关环境基准的研究提供理论依据，为环境标准的建立提供理论支撑。土壤酶作为土壤中几乎所有反应的参与者，研究ENOPs对土壤酶活性的影响对评估纳米氧化物生态效应和土壤环境环境质量具有重要意义。现有ENOPs在生物毒性和土壤微生物效应方面的研究为评价纳米氧化物在土壤中的环境风险积累了一定的基础。已有的研究结论主要针对某些种类的ENOPs，并且依赖于实验室模拟或建模的结果，而非针对实际现有工程的研究。

随着对ENOPs生物毒性研究逐步深入，其对土壤酶活性的影响应在以下几个方面进一步完善和发展。1) 深入污染地块进行原位实验以弥补室内模拟实验数据的差异性，研究真实环境下ENOPs对土壤酶的作用机理。2) 建立ENOPs与土壤酶活性之间的剂量-效应关系，将不同纳米材料的剂量与其对土壤的污染程度对应起来，并筛选对ENOPs敏感性较强的土壤酶，构建出更加科学合理的土壤酶学指标，更全面准确地反映纳米氧化物对土壤酶的毒性效应。3) ENOPs在土壤中的团聚会影响土壤酶活性的变化，但不同团聚程度对其影响机理尚不清楚，针对ENOPs团聚特性及其对土壤酶活性影响的研究亟待开展。4) 考虑到土壤作为ENOPs释放到环境中的汇，其污染具有复合性，未来的研究应涉及多种人工纳米材料复合污染对土壤酶的影响。5) ENOPs是一种环境背景值相对缺失的新兴土壤污染物，尚待建立相关的环境基准和质量标准。

通讯作者简介：蒲生彦(1981—)，男，博士(后)，教授，香江学者，四川省千人计划特聘专家。目前主要从事水土污染协同控制、土壤地下水污染风险预警及环境基准相关的研究与教学工作。

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