大球盖菇保健酒发酵条件优化研究

李杰，李斌，许彬，郭书贤，于丽萍

（南阳理工学院生化学院，河南南阳473004）

大球盖菇（Stropharia rugoso-annulata）也称酒红色球盖菇、皱环球盖菇，是名贵珍稀食用菌，原产欧美，是欧美各国人工栽培的食用菌之一，也是联合国粮农组织向发展中国家推荐栽培的十大菇种之一[1-7]。大球盖菇子实体富含多糖、皂甙、牛磺酸、总黄酮、多酚、维生素等多种生物活性成分，具有抗衰老，改善心血管功能，促进新陈代谢，提高人体抗病毒、抗细胞突变功能，提高免疫力等生理功能[8-15]。

对大球盖菇的综合利用研究报道比较少，目前，大球盖菇的利用主要是采用传统方法进行简单的加工，如腌渍、罐头加工、制作干品等，产品附加值不高[16-20]。本研究主要是对以大球盖菇为原料研制新型保健酒的发酵条件进行优化，为大球盖菇新型保健酒的研制奠定基础，为我国的大球盖菇资源寻求新的深加工途径，为大球盖菇精深加工提供理论依据，也为进一步大规模开发应用奠定基础。

1 材料

1.1 原料

大球盖菇干品：南阳市社旗县福源生态菌业有限公司。

1.2 菌种

安琪活性酿酒干酵母（最适发酵温度25℃）：安琪酵母股份有限公司。

1.3 液态种子培养基

马铃薯汁200.0 g/L，葡萄糖20.0g/L，KH2PO42.0g/L，MgSO4·7H2O 3.0 g/L100.0 mg/L，pH 值自然，121 ℃灭菌20 min。

1.4 试剂

葡萄糖、（NH4）2SO4、KH2PO4、MgSO4·7H2O、：均为国产分析纯；食品级柠檬酸、白砂糖。

1.5 仪器与设备

LDZX-50FB立式压力蒸汽灭菌锅：上海中安医疗器械厂；TDL-40B台式高速离心机：上海安亭科学仪器厂；101-2A电热鼓风干燥箱、DZKW-4电子恒温水浴锅：北京中兴伟业仪器有限公司；FA1004精密电子分析天平：上海天平仪器厂；DNP-9082电热恒温培养箱：上海精宏试验设备有限公司；HZQ-B恒温摇床：苏州威尔试验用品有限公司；SW-CJ-2G超净工作台：苏州净化设备有限公司。

2 方法

2.1 大球盖菇保健酒生产工艺流程

大球盖菇→清洗→切片→打浆→抽汁→灭菌→过滤→调糖→调pH值→发酵→陈酿→过滤→灭菌→装瓶

2.2 原料预处理

大球盖菇用0.1%的高锰酸钾溶液浸泡20 min，然后用清水洗涤干净。将洗净的大球盖菇切片，每片2 cm～3 cm，加适量自来水打成浆汁，浆汁经真空抽滤、离心除去菇渣得到澄清菇液。大球盖菇澄清汁在65℃下灭菌30 min后备用。

2.3 大球盖菇保健酒发酵条件单因素试验

每个摇瓶装液量150 mL，分别考察酵母接种量（1%、3%、6%、9%、12%）、pH（3.2、3.5、3.8、4.1、4.4）、白砂糖用量[156、189、222、255、288（g/L）]、主发酵时间（5、6、7、8、9 d）、干菇和水的比例[1 ∶8、1 ∶15、1 ∶22、1 ∶29、1 ∶35（g/mL）]对大球盖菇保健酒质量影响，检测指标为酒精度、感官评分。

2.4 大球盖菇保健酒发酵条件均匀设计试验

根据单因素试验结果，选择酵母接种量、pH值、白砂糖用量、干菇和水的比例进行均匀试验设计[21]，由于发酵7 d时已达发酵后期，故确定进行均匀设计试验时发酵天数为7 d，发酵天数不列入均匀试验设计安排表。试验因素水平如表1所示。

表1 均匀设计试验因素水平表Table 1 The factors and levels of uniform design experiment

2.5 酒精度测定

取100 mL大球盖菇发酵酒液原液，再加入50 mL蒸馏水，加热蒸馏，用酒精计测酒精含量[22]。

2.6 大球盖菇保健酒的感官评定

参考葡萄酒品尝学[23]中的感官分析方法对酒样进行感官评定，由10位（男女各5位）从事食品研究与开发的专业人员从澄清度、颜色、气味、口味、风格等方面对大球盖菇保健酒进行评分，结果取平均值。

2.7 BP神经网络的学习及训练

分别根据均匀设计试验的因素个数和需优化指标的个数，利用MATLAB 7.0构建BP神经网络，以均匀设计试验的数据作为BP神经网络的学习和训练样本，以接种量、pH值、白砂糖添加量和料液比作为神经网络的输入参数，分别以感官评分和酒精度作为输出参数，隐层神经元选择经验数10。BP神经网络中输入层、隐含层的传递函数采用tansig，输出层的传递函数采用purelin，训练次数1 000次，训练目标为拟合残差小于0.05，训练模型用于感官评分和酒精度的预测，以确定感官评分和酒精度最高时大球盖菇保健酒的发酵条件[24-30]。

2.8 验证试验

在最优发酵条件下进行3批平行试验，确定每批大球盖菇保健酒的感官评分和酒精度，结果取平均值。

3 结果与讨论

3.1 单因素试验结果及分析

3.1.1 不同接种量对大球盖菇保健酒发酵的影响接种量对大球盖菇保健酒发酵的影响见图1。

图1 接种量对大球盖菇保健酒发酵的影响Fig.1 The effection of inoculum concentration on fermentation of Stropharia rugoso-annulata health wine

由图1可知，酵母接种量为6%时，酒精度和感官评分较高，当酵母量过多过少，都会影响酒精度的高低，且影响酒体的总体质量。

3.1.2 pH值对大球盖菇保健酒发酵的影响

pH值对大球盖菇保健酒发酵的影响见图2。

图2 pH值对大球盖菇保健酒发酵的影响Fig.2 The effection of pH on fermentation of Stropharia rugosoannulata health wine

由图2可知，柠檬酸添加量少，pH值偏高，发酵液的酸度低，柠檬酸添加量多，pH值偏低，发酵液的酸度高。pH值为3.8时，酒的感官质量最佳，而且酒精度较高。

3.1.3 白砂糖添加量对大球盖菇保健酒发酵的影响

白砂糖添加量对大球盖菇保健酒发酵的影响见图3。

图3 白砂糖添加量对大球盖菇保健酒发酵的影响Fig.3 The effection of sugar additive amount on fermentation of Stropharia rugoso-annulata health wine

由图3可知，随着白砂糖添加量的增加，酒精度逐渐升高，适当增加白砂糖的用量，可赋予大球盖菇保健酒良好的口感，感官评分较高。

3.1.4 料液比对大球盖菇保健酒发酵的影响

料液比对大球盖菇保健酒发酵的影响见图4。

图4 料液比对大球盖菇保健酒发酵的影响Fig.4 The effection of solid-liquid ratio on fermentation of Stropharia rugoso-annulata health wine

由图4可知，随料液比的增加，酒精度逐渐提高，料液比对感官评分影响较大，料液比较小时，需要干菇量较多，大球盖菇保健酒颜色较深，当料液比较大时，需要干菇量较少，大球盖菇保健酒酒体颜色太淡，当料液比为1∶35（g/mL）时，保健酒酒体颜色较好，呈微黄色。

3.1.5 发酵时间对大球盖菇保健酒发酵的影响

发酵时间对大球盖菇保健酒发酵的影响见图5。

由图5可知，随着发酵时间的增加酒精度不断上升，第7天时到达发酵后期，酒精度几乎不再上升，第7天发酵液酒香浓郁，具有大球盖菇特有的清香。

图5 发酵时间对大球盖菇保健酒发酵的影响Fig.5 The effection of fermentation time on fermentation of Stropharia rugoso-annulata health wine

3.2 均匀设计试验结果及分析

均匀设计试验方案及试验数据见表3。

表3 均匀设计试验方案及试验数据Table 3 The experiment program and data of uniform design

利用均匀设计V5.0对表3中的试验数据采用逐步回归法进行分析，所得回归方程如下，对试验指标影响不显著的项已去除。

酒精度与各因素关系的回归方程：

显著性水平为0.05，相关系数R为0.962 1，说明回归方程显著，观测值与拟合值误差小，准确度较高。

感官评分与各因素关系的回归方程：

显著性水平为0.05，相关系数R为0.968 5，说明回归方程显著，观测值与拟合值误差小，准确度较高。

对表3均匀设计试验的试验数据以酒精度为指标进行回归拟合及分析，结果见表4。对表3均匀设计试验的试验数据感官评分为指标进行回归拟合及分析，结果见表5。

表4 以酒精度为指标对均匀试验数据进行回归拟合方程的分析结果Table 4 The analysis result of regression fitted equation using uniform experiment data on the indicator of alcoholic strength

表5 以感官评分为指标对均匀试验数据进行回归拟合方程的分析结果Table 5 The analysis result of regression fitted equation using uniform experiment data on the indicator of sensory score

由表4知，各因素对酒精度的主次影响顺序为x3（白砂糖添加量）＞x1（接种量）＞x2（pH值）＞x4（料液比），其中白砂糖添加量和接种量的影响显著（P＜0.05），pH值和料液比的影响不显著。

由表5知，各因素对感官评分的主次影响顺序为x3（白砂糖添加量）＞x1（接种量）＞x2（pH值）＞x4（料液比），其中白砂糖添加量和接种量的影响显著（P＜0.05），pH值和料液比影响不显著。

以酒精度为指标，对回归方程（1）进行寻优求解，可得酒精度最高时接种量x1为10.32%，白砂糖添加量x3为288 g/L，结合单因素试验结果，确定以酒精度为指标时最优发酵条件因素组合为：接种量10.32%，pH值为 3.8，白砂糖添加量 288 g/L，料液比为1 ∶35（g/mL），发酵天数 7 d，此时，酒精度可达12.755 2（体积比）。

利用均匀设计试验中的因素水平及待优化的试验指标数设计BP神经网络的拓扑结构，BP神经网络以感官评分数据进行学习、训练的曲线见图6。

经1 000次迭代训练后，训练曲线收敛，拟合残差为0.045 34，可用于感官评分的预测，将以酒精度为指标时最优发酵条件的数据输入BP神经网络模型，在酒精度最大的条件下BP神经网络预测的感官评分为81.510 1。

以感官评分为指标，对回归方程（2）进行寻优求解，可得感官评分最高时接种量x1为11.77%，白砂糖添加量x3为288 g/L，结合单因素试验结果，确定以感官评分为指标时最优发酵条件因素组合为：接种量11.77%，pH值为3.8，白砂糖添加量288 g/L，料液比为1∶35（g/mL），发酵天数 7 d，此时，感官评分可达 90 分。

利用均匀设计试验中的因素水平及待优化的试验指标数设计BP神经网络的拓扑结构，BP神经网络以酒精度数据进行学习、训练的曲线见图7。

图6 BP神经网络以均匀设计试验中感官评分数据进行学习、训练的曲线Fig.6 The BP neural network learning and training curve based on sensory score data of uniform design experiment

图7 BP神经网络以均匀设计试验中酒精度数据进行学习、训练的曲线Fig.7 The BP neural network learning and training curve based on alcoholic strength data of uniform design experiment

经1 000次迭代训练后，训练曲线收敛，拟合残差为0.042 95，可用于酒精度的预测，将以感官评分为指标时最优发酵条件的数据输入BP神经网络模型，在感官评分最大的条件下BP神经网络预测的酒精度为9.928 2（体积比）。

结合上述分析结果，并根据实际情况综合考虑，最终选择接种量11%、pH3.8、白砂糖添加量288 g/L、料液比1∶35（g/mL），发酵天数7 d，为大球盖菇保健酒最优发酵条件。

在确定的大球盖菇保健酒最优发酵条件下进行3批平行试验，确定每批大球盖菇保健酒的感官评分和酒精度，结果取平均值，结果显示，在最优发酵条件下大球盖菇保健酒的感官评分可达87分，酒精度可达11.34（体积比）。

4 结论

通过综合运用单因素试验、均匀设计试验，结合BP神经网络的模拟和预测作用，对大球盖菇保健酒的发酵条件进行优化，确定大球盖菇保健酒最优的发酵条件为：接种量11%、pH3.8、白砂糖添加量288 g/L、料液比1∶35（g/mL），发酵天数7 d。在此条件下发酵的大球盖菇保健酒质量最好，发酵酒液澄清透明，呈微黄色，香气完整协调，细腻优雅，具有大球盖菇独特的香气，口感清新淡雅。

优化得到的大球盖菇保健酒发酵工艺条件具有良好的工业化应用前景，开发大球盖菇保健酒产品是大球盖菇资源化利用的有效途径之一。

参考文献：

[1]Paul M Kirk,Paul F Cannon,David W Minter,et al.Dictionary of the fungi 10th Edition[M].USA：CABI Publishing,2008：432-434

[2]Carluccio A.The complete mushroom hook[M].Italy：Quadrille Publishing Ltd,2010：165-170

[3]Bruhn N J,N Abright,J D Mihail.Forest farming of winecap Stropharia mushrooms[J].Agroforest Syst,2010,79：267-275

[4]张颖.大球盖菇北方棚内反季栽培技术[J].中国林副特产,2014(6)：54-55

[5]刘逍调,刘梅香,朱慧斌,等.冬闲田稻草生料种植大球盖菇技术[J].现代农业科技,2014(2)：132-133

[6]周祖法,闫静,王伟科.不同培养料配方栽培大球盖菇试验[J].浙江农业科学,2013(2)：149-150

[7]任琪,方显出.秕谷料栽培大球盖菇技术[J].食用菌,2015(4)：53

[8]刘苏,姜玥,罗建平,等.5种食用菌多糖理化性质及免疫活性的比较研究[J].食品科学,2015,36(13)：252-256

[9]杜敏华,王小立,苏海飞,等.大球盖菇多糖超声波提取及抗氧化活性[J].食品研究与开发,2013,34(16)：18-22

[10]陈婵,黄靖,丁玲.超声波辅助提取大球盖菇总黄酮工艺优化[J].食品研究与开发,2015,36(24)：116-119

[11]陈君琛,翁敏劫,赖谱富,等.大球盖菇多糖的分子质量分布及其单糖的组成[J].中国农业科学,2011,44(10)：2109-2117

[12]王蜂,王晓炜,陶明煊,等.大球盖菇多糖清除自由基活性和对D-半乳糖氧化损伤小鼠的抗氧化作用[J].食品科学,2009,30(5)：233-238

[13]段永刚.大球盖菇营养品质分析、黄酮类化合物提取及应用研究[D].福州：福建农林大学,2010

[14]孙兴荣,韩勇武,卞景阳.大球盖菇菌丝体液体发酵培养条件的研究[J].黑龙江农业科学,2016(8)：114-117

[15]Liu Y T,Sun J,Luo Z Y,et a1.Chemical composition of five wild edible mushrooms collected from Southwest China and their antihyperglycemic and antioxidant activity[J].Food and Chemical Toxicology,2012,50(5)：1238-1244

[16]张时,李萍,汪尚法.大球盖菇的采后加工[J].山东蔬菜,2010(1)：43-44

[17]孙兴荣.软包装糖醋大球盖菇罐头的研制[J].黑龙江农业科学,2014(4)：101-104

[18]李萍.大球盖菇采后处理加工方法[J].农家致富,2008(11)：46-47

[19]倪淑君,张海峰,田碧洁,等.大球盖菇采收后的初加工处理技术[J].黑龙江农业科学,2016(7)：158

[20]陈君琛,周学划,赖谱富,等.大球盖菇漂烫液喷雾干燥制营养精粉工艺优化[J].农业工程学报,2012,28(21)：272-279

[21]方开泰,马长兴.正交与均匀试验设计[M].北京：科学出版社,2001[22]中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会.GB 5009.225-2016食品安全国家标准酒中乙醇浓度的测定[S].北京：中国标准出版社,2017

[23]李华.葡萄酒品尝学[M].北京：科学出版社,2010

[24]黄奕雯,戴玉杰,钟成,等.基于人工神经网络模拟啤酒酿造过程中糖度及乙醇浓度的变化[J].中国酿造,2013(1)：25-28

[25]吴丹,杨基先,李昂,等.基于BP神经网络的产絮菌发酵参数的优化[J].哈尔滨工业大学学报,2013(10)：30-35

[26]郭慧慧.基于BP神经网络与遗传算法的苏云金芽胞杆菌发酵优化[J].生物技术进展,2013(2)：137-139

[27]丁城,刘璐,胡勇.基于BP神经网络模型的梨醋发酵产酸量的预测[J].食品科技,2017(2)：273-276

[28]高爱同,毕珂,齐育平,等.BP神经网络和遗传算法在乳酸菌发酵参数优化中的应用[J].应用与环境生物学报,2014(1)：112-116

[29]徐瑾辉,马超,张振华,等.基于SOM与BP神经网络的葡萄酒质量评价[J].长江大学学报(自然科学版),2015(4)：16-20

[30]丛爽.面向MATLAB工具箱的神经网络理论与应用[M].合肥：中国科学技术大学出版社,2009