不同基因型烟草对大鼠脾组织凋亡相关蛋白表达的影响

杜 彬，魏克强

（山西大学生命科学学院，山西 太原 030006）

烟草的固有成分及其燃吸后释放的化学物质决定了烟草烟气化学成分的组成，因此，不同基因型烟草烟气的化学成分具有明显的差异[1-3]，烟气暴露产生的毒理学效应也有所不同[4-6]。通过比较不同基因型烟草烟气化学成分的体内毒理学效应，有助于指导“降毒减害”烟草品种的选育，这对提高卷烟制品的安全性具有重要意义。

烟草烟气中包含的有害成分可通过肺组织进入循环系统，从而影响多组织器官[7]，引起水肿、坏死、凋亡等多种类型的细胞损伤[8-10]。细胞凋亡是一种受严格调控的细胞死亡方式[11]，Bcl-2蛋白家族成员Bcl-2与Bax是其重要的效应蛋白，二者的水平可影响细胞凋亡/抗凋亡的动态平衡[12]。细胞中的Bcl-2和Bax蛋白主要结合于线粒体膜表面，影响线粒体膜结构的稳定性，调节线粒体依赖性细胞凋亡[13]。近年来，有研究表明，烟草烟气可影响细胞中Bcl-2家族蛋白的表达[14-15]。

脾脏作为人体最大的外周免疫器官，是淋巴细胞迁移、免疫应答以及抗体生成的重要场所[16]。长期吸烟将迫使脾脏反复接触血液中的烟草烟气有害成分，对脾组织造成损伤，引起免疫功能失常，严重威胁人体健康。ZHUO等[17]研究表明，烟草烟气暴露可影响脾组织中细胞凋亡的趋势，同时暗示这可能与Bcl-2家族蛋白有关。

本研究以2种基因型的烟草为试验材料，通过单纯全烟气暴露法对SD大鼠进行染毒，通过检测大鼠脾组织中Bcl-2和Bax的表达水平，从Bcl-2/Bax值入手分析烟草烟气暴露对脾组织的影响，评价不同基因型烟草可能的毒理学效应。

1 材料和方法

1.1 试验材料

雄性SD大鼠购自军事医学科学院实验动物中心；供试烟草品种T-1，T-2由山西农业大学烟草育种研究室提供，卷制成单料烟待用。

1.2 试剂

兔抗大鼠Bcl-2多克隆抗体购自Proteintech公司；兔抗大鼠Bax多克隆抗体购自上海生工生物工程股份有限公司；SABC免疫组化试剂盒购自武汉博士德生物工程有限公司；DAB显色试剂盒购自北京中杉金桥生物技术有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 烟气暴露动物毒理模型构建 将24只雄性清洁级SD大鼠随机分为正常空气暴露对照组（CK）和2个烟气暴露处理组（T-1，T-2），每组 8只。参考文献[6-8]中的方法，将SD大鼠置于有机玻璃染毒箱中，每次点燃10支香烟，烟雾泵入染毒箱并维持1 h，每天2次，间隔4 h，每周6 d，持续56 d；对照组正常空气暴露。

1.3.2 脾组织采样及处理 分别于染毒28，56 d各组随机取4只大鼠，10 g/L戊巴比妥钠（3 mL/kg）腹腔注射麻醉。解剖取脾组织，经常规方法制成石蜡包埋组织块。

1.3.3 免疫组织化学染色法检测脾组织Bcl-2和Bax的表达 常规石蜡切片、脱蜡至复水，SABC三步法检测Bcl-2和Bax的表达，DAB显色，苏木精复染后中性树胶封片镜检，100倍放大视野拍照，随机选取5张通过Image Pro Plus 6.0分析图像的积分光密度（Integral optical density，IOD），计算平均光密度，分析Bcl-2和Bax蛋白的表达量，进一步分析脾组织中Bcl-2/Bax值。

1.4 统计分析

使用SPSS 18.0进行统计学分析，所有数据以表示，多组间执行One-way ANOVA单因素方差分析和Duncan's差异显著性检测，P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果与分析

2.1 烟气暴露对脾组织Bcl-2和Bax表达的影响

由图1和表1可知，染毒大鼠脾组织白髓（WP）和红髓（RP）中的Bcl-2表达水平均明显上升（P＜0.05），且T-2组WP的Bcl-2水平显著高于T-1组（P＜0.05）；而在 RP中，染毒28 d时T-2组的表达水平显著高于T-1组（P＜0.05），但56 d时T-1组的Bcl-2水平显著高于T-2组（P＜0.05）。由图2和表1可知，染毒大鼠WP的Bax表达均始终无明显变化（P＞0.05），T-1与T-2组间也无显著差异（P＞0.05）；而在 RP中，Bax的表达均明显增加（P＜0.05），染毒28 d时T-1组显著高于T-2组（P＜0.05），但56 d时T-1和T-2组间无明显差异（P＞0.05）。结果表明，烟草烟气暴露能刺激大鼠脾组织WP和RP中Bcl-2以及RP中Bax的表达，但对WP中Bax表达无明显影响。T-1组Bcl-2和Bax表达水平的变化较T-2组更为明显，说明不同基因型烟草对大鼠脾组织Bcl-2和Bax表达的影响存在明显差异。

表1 烟气暴露大鼠脾组织白髓及红髓中 Bcl-2和Bax的表达水平（n＝4

表1 烟气暴露大鼠脾组织白髓及红髓中 Bcl-2和Bax的表达水平（n＝4

注：*表示与对照组相比差异显著（P＜0.05）；#表示试验组间差异显著（P＜0.05）。表2同。

处理CK T-1 T-2 CK T-1 T-2染毒时间/d 28脾白髓（WP） 脾红髓（RP）56 Bcl-2 5.41±0.64 7.68±1.32*19.05±2.51*#5.03±0.22 8.96±1.87*13.75±2.1*#Bax 2.98±0.21 3.09±0.58 3.12±0.34 2.94±0.26 3.07±0.11 2.94±0.36 Bcl-2 5.91±1.03 12.42±2.32*23.94±3.82*#5.33±0.44 12.35±2.15*8.53±0.77*#Bax 2.37±0.14 4.85±0.27*3.73±0.26*#2.43±0.23 10.11±0.31*9.38±0.86*

2.2 烟草烟气暴露对大鼠脾组织中Bcl-2/Bax值 的影响

表2 香烟烟雾暴露大鼠脾组织Bcl-2/Bax值（n＝8

表2 香烟烟雾暴露大鼠脾组织Bcl-2/Bax值（n＝8

?

对Bcl-2/Bax值的分析表明，与对照组相比，试验组大鼠WP中Bcl-2/Bax值均显著上升（P＜0.05），且T-2组WP的水平显著高于T-1组（P＜0.05）；虽然在染毒28 d时，T-2组RP的Bcl-2/Bax值明显上升且显著高于T-1组（P＜0.05），但染毒结束后T-1和T-2组均显著低于对照组（P＜0.05），且 2个组间无显著差异（P＞0.05）（表 2）。结果说明，烟气暴露后脾组织不同结构的Bcl-2/Bax值有明显差异，同时不同基因型烟草对脾组织Bcl-2/Bax值的影响也具有显著差异。

3 讨论

细胞凋亡是一种调节并维持正常细胞稳态的关键效应，受抗凋亡蛋白Bcl-2和促凋亡蛋白Bax的调控，二者可与线粒体膜上的电压依赖性离子通道相互作用影响细胞色素C依赖性细胞凋亡信号通路[18]，决定下游Caspase-3激活的与否[19-20]。同属Bcl-2蛋白家族的Bcl-2与Bax在细胞中常以二聚体的形式存在并可相互作用，当Bcl-2与Bax水平处于动态平衡时，细胞中多为Bcl-2/Bax异源二聚体，二者动态平衡被打破后，细胞中Bcl-2或Bax同源二聚体增多，增强其抗凋亡或促凋亡作用，影响细胞凋亡趋势[21-22]。因此，Bcl-2/Bax值能在一定程度上体现细胞中Bcl-2与Bax二聚体的水平，反映细胞凋亡的趋势。

通过循环系统进入脾组织的烟草烟气成分可影响细胞Bcl-2与Bax的表达，破坏Bcl-2与Bax之间的动态平衡，改变Bcl-2与Bax间相互作用及其同源或异源二聚体的水平，继而影响脾组织的细胞凋亡[16]。本研究表明，不同基因型烟草烟气暴露后，大鼠脾组织中Bcl-2和Bax水平发生不同程度的变化，导致脾组织细胞的Bcl-2/Bax动态平衡被打破。

NADZRI等[23]和PIEKARSKA等[24]的研究认为，Bcl-2/Bax值的上升可抑制细胞凋亡，导致细胞异常增殖、癌变和慢性炎症等的发生；而Bcl-2/Bax值的下降可能使组织细胞凋亡增强，并造成一定的损伤。本研究中，大鼠脾白髓Bcl-2/Bax值显著升高，表明细胞凋亡受到抑制，这一变化可延长白髓中炎症细胞的寿命，导致异常炎症反应的发生，在MANFREDI等[25]的研究中也有相似的发现。而大鼠脾红髓Bcl-2/Bax值显著降低，说明烟草烟气可促进脾红髓细胞凋亡并导致脾组织损伤。此外，T-1与T-2组大鼠脾组织中Bcl-2和Bax水平以及Bcl-2/Bax值间存在明显差异，这可能是由于不同基因型烟草间化学成分不同，继而对脾组织产生的影响不同。

综上所述，烟草烟气可刺激脾白髓细胞上调Bcl-2/Bax值，与异常炎症的发生有关；而脾红髓更易因烟草烟气暴露而发生细胞凋亡，导致组织损伤。同时烟草基因型不同与脾组织Bcl-2，Bax表达及Bcl-2/Bax值的变化紧密相关，这可能与不同基因型烟草的化学成分存在差异有关。Bcl-2/Bax值一定程度反映了细胞凋亡的趋势，有可能作为评价烟草体内毒理学效应的潜在指标。

［1］张双双.不同产地烤烟化学成分指纹图谱差异研究 [D].郑州：河南农业大学，2012.

［2］席元肖，魏春阳，宋纪真，等.不同香型烤烟化学成分含量的差异[J].烟草科技，2011（5）：29-33，65.

［3］张强，孙力，邱晔，等.云南烤烟主产区烟叶及其烟气主要化学成分的差异分析 [J].云南大学学报（自然科学版），2010，32（S1）：87-91.

［4］武娟，魏克强，任建英.不同基因型烟草体内外毒理学效应的初步分析[J].山西农业科学，2016，44（5）：596-599，613.

［5］张永健，魏克强，杨进文.不同基因型烟草的细胞毒性与致突变性分析[J].山西农业科学，2017，45（3）：374-378.

［6］李佳美，魏克强，冯迎航.2个烟草品种体内毒性差异的比较[J].山西农业科学，2016，44（6）：746-749.

［7］ HALPIN D M.Systemic effects of chronic obstructive pulmonary disease[J].Expert Rev Respir Med，2007，1（1）：75-84.

［8］ KURUS M，UGRAS M，ESREFOGLU M.Effect of resveratrol on tubular damage and interstitial fibrosis in kidneys of rats exposed to cigarette smoke[J].Toxicology&Industrial Health，2009，25（8）：539-544.

［9］ VAN DER TOORN M，SLEBOS D J，DE BRUIN H G，et al.Cigarette smoke-induced blockade of the mitochondrial respiratory chain switches lungepithelial cell apoptosis intonecrosis[J].American Journal of Physiology Lung Cellular&Molecular Physiology，2007，292（5）：1211-1218.

［10］ SHETTY S K，BHANDARY Y P，MARUDAMUTHU A S，et al.Regulation of airway and alveolar epithelial cell apoptosis by p53-induced plasminogen activator inhibitor-1 during cigarette smoke exposure injury[J].American Journal of Respiratory Cell&Molecular Biology，2012，47（4）：474-483.

［11］ KACZANOWSKI S.Apoptosis：its origin，history，maintenance and the medical implications for cancer and aging[J].Physical Biology，2016，13（3）：031001.

［12］WU R，SHI T，WANG M，et al.MicroRNA-497 induces apoptosis and suppresses proliferation via the Bcl-2/Bax-Caspase9-Caspase3 pathway and cyclin D2 protein in HUVECs[J].PLoS ONE，2016，11（12）：e0167052.

［13］ SCHWARZ M，ANDRADE-NAVARRO M A，GROSS A.Mito-chondrial carriers and pores：key regulators of the mitochondrial apoptotic program?[J].Apoptosis，2007，12（5）：869-876.

［14］ FLETCHER N M，ABUSAMAAN M S，MEMAJ I，et al.Oxidative stress：a key regulator of leiomyoma cell survival[J].Fertility&Sterility，2016，107（6）：1387-1394.

［15］KORSMEYER S J，YIN X M，OLTVAI Z N，et al.Reactive oxygen species and the regulation of cell death by the Bcl-2 gene family[J].Biochimica et Biophysica Acta（BBA）-Molecular Basis of Disease，1995（1）：63-66.

［16］MEBIUS R E，KRAAL G.Structure and function of the spleen[J］Nature Reviews Immunology，2005，5（8）：606-616.

［17］ ZHUO S M，LI S C，LIN Y Q，et al.The effects of anti-Fas ribozyme on T lymphocyte apoptosis in mice model with chronic obstructive pulmonary disease[J].Iranian Journal of Basic Medical Sciences，2017，20（10）：1102-1108.

［18］DEMEDTS I K，DEMOOR T，BRACKE K R，et al.Role of apoptosis in the pathogenesis of COPD and pulmonary emphysema[J].Respir Res，2006，7（1）：53-62.

［19］SIDDIQUI WA，AHADA，AHSANH.The mystery of BCL2 family：Bcl-2 proteins and apoptosis:an update[J].Archives of Toxicology，2015，89（3）：289-317.

［20］REDZA-DUTORDOIR M，AVERILL-BATES D A.Activation of apoptosis signalling pathways by reactive oxygen species[J].Biochim Biophys Acta，2016（12）：2977-2992.

［21］ TAYLOR R C，CULLEN S P，MARTIN S J.Apoptosis：controlled demolition at the cellular level[J].Nature Reviews Molecular Cell Biology，2008，9（3）：231-241.

［22］SASI N，HWANG M，JABOIN J，et al.Regulated cell death pathways：newtwists in modulation of BCL2 familyfunction[J].Molecular Cancer Therapeutics，2009，8（6）：1421-1429.

［23］NADZRI N M，ABDUL A B，SUKARI M A，et al.Inclusion complex of zerumbone with hydroxypropyl-β-cyclodextrin induces apoptosis in liver hepatocellular HepG2 cells via caspase 8/BID cleavage switch and modulating Bcl-2/Bax ratio [J].Evidence-Based Complementray and Alternative Medicine，2013（3）：810632.

［24］PIEKARSKA A，KUBIAK R，SZYMCZAK W，et al.Expression of Bax，Bcl-xL and Bcl-2 proteins in relation to grade of inflammation and stage of fibrosis in chronic hepatitis C[J].Histopathology，2007，50（7）：928-935.

［25］MANFREDI A A，ROVEREQUERINI P，D'ANGELO A，et al.Low molecular weight heparins prevent the induction of autophagy of activated neutrophils and the formation of neutrophil extracellular traps[J].Pharmacological Research，2017，123（9）：146-156.